Las pruebas de esterilidad USP <71> son el ensayo microbiológico con el que se verifica la ausencia de microorganismos viables en un lote de producto estéril: están descritas en el capítulo general USP <71> de la Farmacopea de los Estados Unidos y en el capítulo 2.6.1 de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.), dos textos armonizados a través del Pharmacopoeial Discussion Group (PDG). Sobre el papel es un ensayo sencillo — inocular, incubar, observar —, pero en la práctica es uno de los más delicados del laboratorio de control de calidad: un falso positivo bloquea un lote y desencadena una investigación compleja, mientras que una ejecución no conforme con la farmacopea es una observación inmediata en auditoría. En esta guía repasamos métodos, medios, muestreo y gestión de resultados, con los puntos que QA y QC deben controlar para estar listos para la auditoría.
Pruebas de esterilidad USP <71> y Ph. Eur. 2.6.1: qué exigen las farmacopeas
La prueba de esterilidad según farmacopea se aplica a sustancias, preparaciones y artículos que deben ser estériles: parenterales, oftálmicos y otras formas farmacéuticas cuando la monografía lo exige. Ambos capítulos precisan un concepto clave: un resultado satisfactorio solo indica que no se ha encontrado contaminación en la muestra examinada, en las condiciones del ensayo. La esterilidad del lote no puede "probarse dentro" del producto: la garantiza el proceso. Lo refuerza el Anexo 1 de las GMP de la UE (rev. 2022), que en el punto 2.7 advierte que la garantía de esterilidad no debe apoyarse únicamente en ningún proceso terminal ni en el ensayo del producto terminado. La prueba sigue siendo, en todo caso, un requisito de liberación: debe realizarse en condiciones asépticas controladas — bajo cabina de flujo laminar en sala limpia o, cada vez más, en aislador — que no deben influir en el resultado del ensayo.
Filtración por membrana o inoculación directa: cómo elegir el método
Las farmacopeas contemplan dos técnicas:
- Filtración por membrana: el producto se filtra a través de una membrana con un tamaño de poro nominal no superior a 0,45 µm, que retiene los microorganismos; después la membrana se lava (típicamente con al menos tres porciones de solución de lavado, para eliminar residuos antimicrobianos) y se transfiere o incuba en los medios de cultivo. Es la técnica de elección siempre que la naturaleza del producto lo permita: soluciones acuosas, preparaciones alcohólicas u oleosas filtrables, sólidos solubles.
- Inoculación directa: una cantidad definida de producto se transfiere directamente al medio, con un volumen de producto no superior al 10% del volumen del medio. Se utiliza cuando la filtración no es practicable (suspensiones, pomadas no solubilizables, dispositivos particulares).
La elección no es libre: debe justificarse por la naturaleza del producto y respaldarse con el ensayo de idoneidad del método. En auditoría, una inoculación directa de un producto filtrable sin justificación documentada es una observación clásica.
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Medios de cultivo, temperaturas y tiempos de incubación
La prueba utiliza dos medios complementarios, cada uno con su propia ventana de incubación. Los medios inoculados se incuban durante no menos de 14 días, con observaciones periódicas y una lectura final documentada.
| Parámetro | Tioglicolato fluido (FTM) | Digerido de soja-caseína (TSB/SCDM) |
|---|---|---|
| Microorganismos diana | Bacterias anaerobias (y aerobias) | Hongos y bacterias aerobias |
| Temperatura de incubación | 30–35 °C | 20–25 °C |
| Duración mínima | 14 días | 14 días |
| Promoción de crecimiento (ejemplos) | S. aureus, P. aeruginosa, C. sporogenes | C. albicans, A. brasiliensis, B. subtilis |
Cada lote de medio debe superar el control de esterilidad del propio medio y el ensayo de promoción de crecimiento: inóculo no superior a 100 UFC por cepa, con crecimiento visible en un máximo de 3 días para bacterias y 5 días para hongos. Un medio no cualificado invalida todo lo que se haya sembrado en él.
Idoneidad del método: el prerrequisito que los inspectores revisan primero
Antes de aplicar la prueba a un producto hay que demostrar que el propio producto no inhibe el crecimiento microbiano en las condiciones del ensayo (bacteriostasis/fungistasis). El ensayo de idoneidad se realiza inoculando las cepas de referencia (no más de 100 UFC) en presencia del producto, con la misma técnica del ensayo de rutina: si el crecimiento es comparable al control sin producto, el método es idóneo; en caso contrario se modifican las condiciones — más lavados de la membrana, neutralizantes, mayor dilución — y se repite la verificación. La idoneidad debe revisarse cuando cambia la formulación, el método o un proveedor crítico. Un expediente de idoneidad incompleto o nunca actualizado es una de las observaciones más frecuentes en las inspecciones a laboratorios de microbiología.
Cuántas muestras analizar: cantidades mínimas y número de envases
Las farmacopeas definen en tablas armonizadas tanto la cantidad mínima a analizar por envase como el número mínimo de envases por lote:
- Cantidad por envase (Ph. Eur. tabla 2.6.1.-2): por ejemplo, para líquidos de 1 a 40 mL se analiza la mitad del contenido de cada envase y en todo caso no menos de 1 mL; para sólidos de 50 a 300 mg, la mitad del contenido y no menos de 50 mg.
- Número de envases (Ph. Eur. tabla 2.6.1.-3): en función del tamaño del lote; para preparaciones parenterales típicamente hasta 20 envases por lote, para oftálmicos hasta 10.
El muestreo debe ser representativo: para productos esterilizados en autoclave, incluir las posiciones más frías de la carga; para procesos asépticos, el Anexo 1 espera que las muestras incluyan unidades llenadas al inicio y al final del llenado y tras las intervenciones significativas. Un plan de muestreo "al azar" sin esta justificación es indefendible en una inspección.
Resultado positivo: interpretación, invalidación y repetición
Si tras 14 días ningún medio muestra crecimiento, el producto supera la prueba. Si aparece crecimiento, el lote no es conforme, salvo que la investigación de laboratorio demuestre que el ensayo es inválido. Las farmacopeas admiten la invalidación solo por causas inequívocas, por ejemplo:
- el monitoreo microbiológico del área de ensayo revela un fallo o una contaminación ambiental;
- la revisión del procedimiento evidencia un error técnico en la ejecución;
- los controles negativos muestran crecimiento;
- el microorganismo aislado se atribuye sin ambigüedad a materiales o técnica ajenos al producto.
Solo en estos casos puede repetirse la prueba con el mismo número de unidades; el lote es conforme si la repetición no muestra crecimiento. La identificación del contaminante y su comparación con los datos del monitoreo ambiental son, por tanto, parte integrante de la investigación OOS, que debe gestionarse con la misma disciplina documental que una desviación crítica.
Recomendación GuideGxP
Nuestro consejo operativo es tratar la prueba de esterilidad como un proceso, no como un ensayo aislado: cualificación del entorno de ensayo (aislador o sala limpia), cualificación de los medios lote a lote, idoneidad del método actualizada para cada producto, plan de muestreo con justificación escrita y un flujo de investigación predefinido para los positivos, vinculado al monitoreo ambiental. Si el producto se destina a varios mercados, verifica las diferencias residuales entre Ph. Eur., USP y JP antes de que lo haga un auditor: incluso en capítulos armonizados, los detalles editoriales y las monografías nacionales pueden divergir. Sobre este punto, nuestra guía Farmacopeas comparadas en GMP: gestión operativa de las divergencias USP – Ph. Eur. – JP – BP ofrece matrices listas para usar para documentar las decisiones compendiales y defenderlas en auditoría.
