Il test di sterilità secondo farmacopea è il saggio microbiologico con cui si verifica l'assenza di microrganismi vitali in un lotto di prodotto sterile: è descritto nel capitolo 2.6.1 della Farmacopea Europea (Ph.Eur.) e nel capitolo generale USP <71> della Farmacopea statunitense, due testi armonizzati attraverso il Pharmacopoeial Discussion Group (PDG). Sulla carta è un test semplice — inoculare, incubare, osservare — ma in pratica è uno dei saggi più delicati del laboratorio QC: un falso positivo blocca un lotto e innesca un'indagine complessa, mentre un'esecuzione non conforme alla farmacopea è un finding immediato in audit. In questa guida vediamo metodi, terreni, campionamento e gestione dei risultati, con i punti che QA e QC devono presidiare per essere audit-ready.
Test di sterilità secondo farmacopea: cosa richiedono Ph.Eur. 2.6.1 e USP <71>
Il test di sterilità secondo farmacopea si applica a sostanze, preparazioni e articoli che, in base alla farmacopea, devono essere sterili: parenterali, oftalmici e altre forme per le quali la monografia lo prevede. Entrambi i capitoli precisano però un concetto chiave: un esito favorevole indica soltanto che non è stata trovata contaminazione nel campione esaminato, nelle condizioni del test. La sterilità del lotto non può essere "testata dentro" il prodotto: è garantita dal processo. Lo ribadisce anche l'Annex 1 EU GMP (rev. 2022), che al punto 2.7 avverte che la garanzia di sterilità non deve poggiare unicamente su alcun processo terminale o test sul prodotto finito. Il test resta comunque un requisito di rilascio: deve essere eseguito in condizioni asettiche controllate — sotto cappa a flusso laminare in cleanroom o, sempre più spesso, in isolatore — che non devono influenzare l'esito del saggio.
Filtrazione su membrana o inoculo diretto: come scegliere il metodo
Le farmacopee prevedono due tecniche:
- Filtrazione su membrana: il prodotto viene filtrato attraverso una membrana con porosità nominale non superiore a 0,45 µm, che trattiene i microrganismi; la membrana viene poi lavata (tipicamente con almeno tre porzioni di soluzione di lavaggio, per rimuovere i residui antimicrobici) e trasferita o incubata nei terreni di coltura. È la tecnica di prima scelta ogni volta che la natura del prodotto lo consente: soluzioni acquose, preparazioni alcoliche o oleose filtrabili, solidi solubili.
- Inoculo diretto: una quantità definita di prodotto viene trasferita direttamente nel terreno, con un volume di prodotto non superiore al 10% del volume del terreno. Si usa quando la filtrazione non è praticabile (sospensioni, unguenti non solubilizzabili, dispositivi particolari).
La scelta non è libera: va giustificata dalla natura del prodotto e supportata dal method suitability test. In audit, un inoculo diretto su un prodotto filtrabile senza razionale documentato è una classica osservazione.
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Terreni di coltura, temperature e tempi di incubazione
Il test utilizza due terreni complementari, ciascuno con la propria finestra di incubazione. L'incubazione dei terreni inoculati dura non meno di 14 giorni, con osservazioni periodiche e lettura finale documentata.
| Parametro | Tioglicollato fluido (FTM) | Soia-caseina digerito (TSB/SCDM) |
|---|---|---|
| Microrganismi bersaglio | Batteri anaerobi (e aerobi) | Funghi e batteri aerobi |
| Temperatura di incubazione | 30–35 °C | 20–25 °C |
| Durata minima | 14 giorni | 14 giorni |
| Growth promotion (esempi) | S. aureus, P. aeruginosa, C. sporogenes | C. albicans, A. brasiliensis, B. subtilis |
Ogni lotto di terreno deve superare il test di sterilità del terreno stesso e il growth promotion test: inoculo non superiore a 100 CFU per ceppo, con crescita visibile entro 3 giorni per i batteri e 5 giorni per i funghi. Terreni non qualificati invalidano tutto ciò che vi è stato seminato.
Method suitability: il prerequisito che gli ispettori controllano per primo
Prima di applicare il test a un prodotto, occorre dimostrare che il prodotto stesso non inibisca la crescita microbica nelle condizioni del saggio (bacteriostasis/fungistasis). Il method suitability test si esegue inoculando i ceppi di riferimento (non più di 100 CFU) in presenza del prodotto, con la stessa tecnica del test di routine: se la crescita è comparabile al controllo senza prodotto, il metodo è idoneo; in caso contrario si modificano le condizioni — più lavaggi della membrana, neutralizzanti, maggiore diluizione — e si ripete la verifica. La suitability va rivista quando cambia la formulazione, il metodo o il fornitore critico. Un dossier di suitability incompleto o mai aggiornato è tra i rilievi più frequenti nelle ispezioni ai laboratori di microbiologia.
Quanti campioni testare: quantità minime e numero di contenitori
Le farmacopee definiscono in tabelle armonizzate sia la quantità minima da testare per contenitore sia il numero minimo di contenitori per lotto:
- Quantità per contenitore (Ph.Eur. tabella 2.6.1.-2): ad esempio, per liquidi da 1 a 40 mL si testa metà del contenuto di ciascun contenitore e comunque non meno di 1 mL; per solidi da 50 a 300 mg, metà del contenuto e non meno di 50 mg.
- Numero di contenitori (Ph.Eur. tabella 2.6.1.-3): in funzione della dimensione del lotto; per le preparazioni parenterali si arriva tipicamente fino a 20 contenitori per lotto, per gli oftalmici fino a 10.
Il campionamento deve essere rappresentativo: per i prodotti sterilizzati in autoclave includere le posizioni più fredde del carico; per i processi asettici, l'Annex 1 richiede che i campioni includano unità riempite a inizio e fine riempimento e dopo gli interventi significativi. Un piano di campionamento "a caso" senza questo razionale è indifendibile in ispezione.
Risultato positivo: interpretazione, invalidazione e retest
Se dopo 14 giorni nessun terreno mostra crescita, il prodotto supera il test. Se compare crescita, il lotto non è conforme, a meno che l'indagine di laboratorio non dimostri che il test è invalido. Le farmacopee ammettono l'invalidazione solo per cause inequivocabili, ad esempio:
- il monitoraggio microbiologico dell'area di prova rivela un guasto o una contaminazione ambientale;
- la revisione della procedura evidenzia un errore tecnico nell'esecuzione;
- i controlli negativi mostrano crescita;
- il microrganismo isolato è attribuito senza ambiguità a materiali o tecnica estranei al prodotto.
Solo in questi casi il test può essere ripetuto con lo stesso numero di unità; il lotto è conforme se il retest non mostra crescita. L'identificazione del contaminante e il confronto con i dati del monitoraggio ambientale sono quindi parte integrante dell'indagine OOS, da gestire con la stessa disciplina documentale di una deviazione critica.
Raccomandazione GuideGxP
Il consiglio operativo è di trattare il test di sterilità come un processo, non come un singolo saggio: qualifica dell'ambiente di prova (isolatore o cleanroom), qualifica dei terreni lotto per lotto, method suitability aggiornata per ogni prodotto, piano di campionamento con razionale scritto e un flusso d'indagine predefinito per i positivi, collegato al monitoraggio ambientale. Se il prodotto è destinato a più mercati, verifica le differenze residue tra Ph.Eur., USP e JP prima che lo faccia un auditor: anche su capitoli armonizzati, dettagli editoriali e monografie nazionali possono divergere. Su questo punto la nostra guida Farmacopee a Confronto GMP: gestione operativa delle divergenze USP – Ph. Eur. – JP – BP offre matrici pronte all'uso per documentare le scelte compendiali e difenderle in audit.
