L'essai de stérilité selon la pharmacopée est l'essai microbiologique qui permet de vérifier l'absence de micro-organismes viables dans un lot de produit stérile : il est décrit au chapitre 2.6.1 de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur.) et au chapitre général USP <71> de la Pharmacopée américaine, deux textes harmonisés via le Pharmacopoeial Discussion Group (PDG). Sur le papier, c'est un essai simple — inoculer, incuber, observer — mais en pratique c'est l'un des essais les plus délicats du laboratoire de contrôle qualité : un faux positif bloque un lot et déclenche une investigation complexe, tandis qu'une exécution non conforme à la pharmacopée constitue un écart immédiat en audit. Dans ce guide, nous passons en revue méthodes, milieux, échantillonnage et gestion des résultats, avec les points que l'AQ et le CQ doivent maîtriser pour rester prêts à l'audit.
Essai de stérilité selon la pharmacopée : ce qu'exigent Ph. Eur. 2.6.1 et USP <71>
L'essai de stérilité selon la pharmacopée s'applique aux substances, préparations et articles qui doivent être stériles : formes parentérales, ophtalmiques et toute autre forme pour laquelle la monographie l'exige. Les deux chapitres précisent un concept clé : un résultat favorable indique seulement qu'aucune contamination n'a été trouvée dans l'échantillon examiné, dans les conditions de l'essai. La stérilité du lot ne peut pas être « testée dans » le produit : elle est garantie par le procédé. L'Annexe 1 des BPF de l'UE (rév. 2022) le rappelle au point 2.7 : l'assurance de stérilité ne doit pas reposer uniquement sur un procédé terminal ou sur l'essai du produit fini. L'essai reste néanmoins une exigence de libération : il doit être réalisé dans des conditions aseptiques maîtrisées — sous hotte à flux laminaire en salle propre ou, de plus en plus souvent, en isolateur — qui ne doivent pas influencer le résultat de l'essai.
Filtration sur membrane ou inoculation directe : comment choisir la méthode
Les pharmacopées prévoient deux techniques :
- Filtration sur membrane : le produit est filtré à travers une membrane de porosité nominale inférieure ou égale à 0,45 µm, qui retient les micro-organismes ; la membrane est ensuite rincée (typiquement avec au moins trois portions de solution de rinçage, pour éliminer les résidus antimicrobiens) puis transférée ou incubée dans les milieux de culture. C'est la technique de premier choix chaque fois que la nature du produit le permet : solutions aqueuses, préparations alcooliques ou huileuses filtrables, solides solubles.
- Inoculation directe : une quantité définie de produit est transférée directement dans le milieu, le volume de produit ne dépassant pas 10 % du volume du milieu. Elle s'utilise lorsque la filtration n'est pas praticable (suspensions, pommades non solubilisables, dispositifs particuliers).
Le choix n'est pas libre : il doit être justifié par la nature du produit et étayé par l'essai d'aptitude de la méthode. En audit, une inoculation directe d'un produit filtrable sans justification documentée est une observation classique.
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Milieux de culture, températures et durées d'incubation
L'essai utilise deux milieux complémentaires, chacun avec sa propre fenêtre d'incubation. Les milieux inoculés sont incubés pendant au moins 14 jours, avec des observations périodiques et une lecture finale documentée.
| Paramètre | Thioglycolate fluide (FTM) | Hydrolysat de soja-caséine (TSB/SCDM) |
|---|---|---|
| Micro-organismes cibles | Bactéries anaérobies (et aérobies) | Champignons et bactéries aérobies |
| Température d'incubation | 30–35 °C | 20–25 °C |
| Durée minimale | 14 jours | 14 jours |
| Fertilité / growth promotion (exemples) | S. aureus, P. aeruginosa, C. sporogenes | C. albicans, A. brasiliensis, B. subtilis |
Chaque lot de milieu doit satisfaire au contrôle de stérilité du milieu lui-même et à l'essai de fertilité (growth promotion) : inoculum ne dépassant pas 100 UFC par souche, avec une croissance visible en 3 jours maximum pour les bactéries et 5 jours pour les champignons. Un milieu non qualifié invalide tout ce qui y a été ensemencé.
Aptitude de la méthode : le prérequis que les inspecteurs vérifient en premier
Avant d'appliquer l'essai à un produit, il faut démontrer que le produit lui-même n'inhibe pas la croissance microbienne dans les conditions de l'essai (bactériostase/fongistase). L'essai d'aptitude est réalisé en inoculant les souches de référence (au plus 100 UFC) en présence du produit, avec la même technique que l'essai de routine : si la croissance est comparable au témoin sans produit, la méthode est apte ; sinon, on modifie les conditions — rinçages supplémentaires de la membrane, neutralisants, dilution plus importante — et on répète la vérification. L'aptitude doit être réévaluée en cas de changement de formulation, de méthode ou de fournisseur critique. Un dossier d'aptitude incomplet ou jamais mis à jour figure parmi les écarts les plus fréquents lors des inspections des laboratoires de microbiologie.
Combien d'échantillons tester : quantités minimales et nombre de récipients
Les pharmacopées définissent dans des tableaux harmonisés à la fois la quantité minimale à tester par récipient et le nombre minimal de récipients par lot :
- Quantité par récipient (Ph. Eur. tableau 2.6.1.-2) : par exemple, pour les liquides de 1 à 40 mL, la moitié du contenu de chaque récipient et en tout cas pas moins de 1 mL ; pour les solides de 50 à 300 mg, la moitié du contenu et pas moins de 50 mg.
- Nombre de récipients (Ph. Eur. tableau 2.6.1.-3) : selon la taille du lot ; pour les préparations parentérales typiquement jusqu'à 20 récipients par lot, pour les ophtalmiques jusqu'à 10.
L'échantillonnage doit être représentatif : pour les produits stérilisés à l'autoclave, inclure les positions les plus froides de la charge ; pour les procédés aseptiques, l'Annexe 1 attend que les échantillons incluent des unités remplies en début et en fin de remplissage ainsi qu'après les interventions significatives. Un plan d'échantillonnage « au hasard » sans cette justification est indéfendable en inspection.
Résultat positif : interprétation, invalidation et nouvel essai
Si après 14 jours aucun milieu ne montre de croissance, le produit satisfait à l'essai. Si une croissance apparaît, le lot est non conforme, sauf si l'investigation de laboratoire démontre que l'essai est invalide. Les pharmacopées n'admettent l'invalidation que pour des causes sans équivoque, par exemple :
- la surveillance microbiologique de la zone d'essai révèle une défaillance ou une contamination environnementale ;
- la revue de la procédure met en évidence une erreur technique dans l'exécution ;
- les témoins négatifs montrent une croissance ;
- le micro-organisme isolé est attribué sans ambiguïté à des matériels ou à une technique étrangers au produit.
Dans ces seuls cas, l'essai peut être répété avec le même nombre d'unités ; le lot est conforme si le nouvel essai ne montre aucune croissance. L'identification du contaminant et la comparaison avec les données de surveillance environnementale font donc partie intégrante de l'investigation OOS, à gérer avec la même discipline documentaire qu'une déviation critique.
Recommandation GuideGxP
Notre conseil opérationnel : traiter l'essai de stérilité comme un procédé, pas comme un essai isolé — qualification de l'environnement d'essai (isolateur ou salle propre), qualification des milieux lot par lot, aptitude de la méthode à jour pour chaque produit, plan d'échantillonnage avec justification écrite et un flux d'investigation prédéfini pour les positifs, relié à la surveillance environnementale. Si le produit est destiné à plusieurs marchés, vérifiez les différences résiduelles entre Ph. Eur., USP et JP avant qu'un auditeur ne le fasse : même sur des chapitres harmonisés, des détails éditoriaux et des monographies nationales peuvent diverger. Sur ce point, notre guide Pharmacopées comparées en GMP : gestion opérationnelle des divergences USP – Ph. Eur. – JP – BP propose des matrices prêtes à l'emploi pour documenter les choix compendiaux et les défendre en audit.
