Diluizioni seriali: calcoli, esecuzione e controllo degli errori

La formula può essere corretta mentre la soluzione è sbagliata: basta usare il volume del solvente al posto del volume finale, saltare una miscelazione o prelevare dalla provetta precedente a quella prevista. Una diluizione seriale richiede un modello quantitativo chiaro e una sequenza ricostruibile. I passaggi aggiuntivi rendono accessibili alcuni rapporti elevati, ma introducono anche altre occasioni di errore.

Partire dalla concentrazione e dalle unità

Indica che cosa significa la concentrazione: massa di analita per volume di soluzione, quantità di sostanza per volume oppure frazione massica. mg/mL e µg/mL sono convertibili; mol/L richiede anche identità chimica e massa molare appropriate. Non trattare percentuali m/m, m/V e V/V come sinonimi e non convertire una frazione massica mediante soli volumi senza i dati necessari, come la densità.

Uniforma le unità prima di sostituire i valori. Per esempio, 1 mg/mL equivale a 1000 µg/mL e 1 mL a 1000 µL. Mantieni distinta la concentrazione assegnata della soluzione madre dai fattori successivi. Se il metodo richiede correzioni per titolo, purezza o altra base di espressione, applicale nel punto previsto e rendile verificabili, evitando di introdurle due volte.

Usare C₁V₁ = C₂V₂ con le sue ipotesi

Per una diluizione senza perdita o formazione dell’analita, C₁ × V₁ = C₂ × V₂. C₁ è la concentrazione della soluzione prelevata; V₁ il volume dell’aliquota trasferita; C₂ la concentrazione ottenuta; V₂ il volume finale della nuova soluzione. V₁ non è necessariamente tutto il contenuto del recipiente iniziale. La relazione esprime un bilancio, illustrato anche nel materiale didattico del Rose-Hulman Institute of Technology sulle diluizioni.

Il modello presuppone un’aliquota rappresentativa, trasferimento quantitativo e analita conservato nella forma misurata. Adsorbimento, degradazione o precipitazione possono invalidarne l’applicazione semplice. Il diluente non deve apportare una quantità non considerata dell’analita. L’equazione volumetrica non si applica automaticamente a percentuali m/m: in quel caso occorre un bilancio basato sulle masse.

Portare 2 mL a 100 mL non equivale ad aggiungere 100 mL di solvente. Inoltre, il volume finale non è sempre la somma dei volumi iniziali: il rapporto NISTIR 8342 lo mostra per miscele etanolo–acqua. Segui quindi la modalità prevista per ottenere il volume finale, considerando le condizioni termiche pertinenti.

Moltiplicare i fattori della sequenza

Qui definiamo il fattore F = V_finale/V_aliquota, maggiore di 1 per una diluizione. La concentrazione si divide per F. Alcune risorse usano il reciproco: dichiarare la convenzione evita ambiguità. “1:10” da solo è meno chiaro di “prelevare 1 mL e portare a 10 mL finali”.

Esempio numerico simulato. Una soluzione madre S contiene nominalmente 1000 µg/mL. Si assumono soluzioni omogenee e stabili, assenza di perdite e volumi finali correttamente ottenuti. I valori sono didattici, non una procedura validata né una dichiarazione d’incertezza.

F_totale = 50 × 10 × 2 = 1000; C_C = 1000/1000 = 1 µg/mL. I fattori non devono essere uguali. In una serie, ogni passaggio usa la soluzione precedente indicata; preparare tutti i livelli direttamente dalla madre è un disegno diverso e va calcolato separatamente.

Scegliere volumi realmente eseguibili

Progetta i passaggi entro i campi d’uso dimostrati degli strumenti, considerando liquido, puntali, recipiente e volume necessario per analisi e controlli. Una singola diluizione può richiedere un’aliquota inadatta al sistema disponibile; molte tappe possono invece aumentare trasferimenti, consumo e contributi d’incertezza. Confronta le alternative rispetto allo scopo, senza presumere che più passaggi siano sempre migliori.

Per le pipette considera la tecnica compatibile con il liquido e il sistema pipetta–puntale. Un matraccio definisce un volume contenuto; non è automaticamente uno strumento per erogare quel volume. ISO 1042:1998 riguarda i matracci a un tratto; il riferimento non sostituisce identificazione, stato e idoneità della vetreria effettivamente usata.

Miscelare, trasferire e identificare ogni soluzione

Prepara identificativi inequivocabili per madre e soluzioni derivate. Verifica origine e destinazione prima del prelievo, esegui la miscelazione prevista prima dell’aliquota successiva e registra quantità e sequenza durante il lavoro. Definisci modalità compatibili con matrice e contenitore: schiuma, sedimentazione o evaporazione possono compromettere il prelievo.

Conserva il collegamento fra soluzione, operatore, strumento, diluente e orari critici. La quantità disponibile dopo un prelievo diminuisce, ma la concentrazione della soluzione omogenea rimasta non cambia per quel solo prelievo. Non confondere quindi volume residuo e fattore di diluizione. Proteggi le preparazioni nelle condizioni e per i tempi dimostrati dal metodo.

Distinguere errori e contributi condivisi

Un errore di esecuzione identificato non si gestisce semplicemente ampliando l’incertezza. Per una sequenza correttamente eseguita, il modello include invece concentrazione della madre e rapporti volumetrici. Se la stessa pipetta o lo stesso riferimento contribuisce a più passaggi, alcuni effetti possono essere condivisi: non sono automaticamente osservazioni indipendenti.

La legge di propagazione dell’incertezza descritta da NIST comprende le covarianze. La somma quadratica dei soli contributi relativi è una semplificazione che richiede ipotesi appropriate. Il segno e l’entità dell’effetto dipendono dal modello; una causa comune può influenzare più livelli insieme. Ripetere la lettura della soluzione finale non rende indipendenti le preparazioni.

Conserva cifre sufficienti nei calcoli intermedi e arrotonda secondo le regole del metodo. Molti decimali non dimostrano accuratezza. Correzioni metrologiche documentate e previste sono diverse da fattori inventati per far tornare un risultato.

Controllare a ritroso e ricostruire un errore

Il controllo inverso dell’esempio parte da C: 1 × (20/10) = 2 µg/mL in B; 2 × (50/5) = 20 in A; 20 × (100/2) = 1000 nella madre. Verifica anche unità, origine dei dati e trascrizioni. Il capitolo 6 delle EU GMP richiede un esame critico dei calcoli; rileggere la stessa formula copiata non è un controllo indipendente efficace.

Caso simulato. Nel passaggio B vengono trasferiti 4,00 mL di A invece di 5,00 mL, sempre a 50,0 mL finali. Nelle ipotesi dell’esempio, B contiene 20 × 4/50 = 1,6 µg/mL; C, preparata come previsto da B, contiene 0,8 µg/mL, il 20% in meno dell’obiettivo. A resta fuori da questo specifico errore, salvo altre evidenze. Le ulteriori soluzioni derivate da B sono coinvolte.

Blocca le preparazioni interessate, conserva i dati originari e documenta l’evento. Il calcolo chiarisce l’impatto teorico ma non autorizza rietichettatura, aggiunte o utilizzo fuori metodo. Il responsabile stabilisce indagine e percorso di ripetizione. Integra questi controlli nel flusso di preparazione dei campioni dell’area PL-03.

Per approfondire i passaggi collegati: Pesata analitica: tecnica, elettricità statica e trasferimento del campione.

Fonti e limiti dell’esempio

Fonti consultate il 30 settembre 2026: materiale didattico Rose-Hulman, sezione sulle diluizioni; NIST TN 1297 (1994), appendice A; NISTIR 8342 (2021), non additività dei volumi; EU GMP capitolo 6 (2014). ISO 1042:1998: scheda pubblica, edizione pubblicata; la revisione ISO/DIS 1042 è ancora in sviluppo. Nessuna tolleranza è ricavata dal testo ISO non consultato. Tabella e caso sono originali e verificati aritmeticamente, senza simulare risultati sperimentali.