Test di sterilità: filtrazione su membrana o inoculo diretto?

La scelta tra filtrazione su membrana e inoculo diretto nel test di sterilità dipende dal prodotto, dal riferimento compendiale applicabile e dalla capacità del metodo di rivelare la contaminazione nelle condizioni reali della prova. La filtrazione è la via da valutare quando la natura del prodotto la consente; l’inoculo diretto non è una scorciatoia per evitare lo studio delle interferenze. In entrambi i casi occorre dimostrare l’idoneità per la matrice e poter interpretare il risultato. [1–3]

Questo articolo aiuta a costruire la motivazione della scelta: che cosa verificare, quali evidenze conservare e dove fermarsi se rimangono incertezze. La matrice decisionale e i due casi sono originali GuideGxP. Non costituiscono una procedura analitica, né sostituiscono il metodo approvato e il testo compendiale vigente applicabile al prodotto.

1. Che cosa dimostra il test, e che cosa non dimostra

Un risultato soddisfacente indica che nel campione esaminato non sono stati rilevati microrganismi contaminanti nelle condizioni della prova. Non dimostra, da solo, l’assenza di contaminazione in ogni unità del lotto. L’Annex 1 EU GMP considera il test finale come l’ultimo di una serie di controlli: non può compensare carenze dei parametri di progettazione, procedura o validazione del prodotto e del processo. [1,3]

Questa distinzione cambia la domanda iniziale. Non basta chiedere quale tecnica produca più facilmente un risultato negativo. Occorre chiedere quale percorso mantenga la capacità di rilevazione, rispetti i requisiti applicabili e renda ricostruibili le condizioni della prova. Un campione limpido non prova assenza di inibizione; un sistema chiuso non dimostra automaticamente che la manipolazione sia stata corretta.

Il campionamento rimane un’altra decisione essenziale, da definire con i riferimenti applicabili e la conoscenza del processo. Qui non vengono proposti numeri di contenitori, quantità per terreno, tempi o temperature universali. Se il laboratorio non ha chiarito quale metodo e quale piano siano autorizzati, la scelta dell’apparecchiatura viene troppo presto.

2. Stabilire il riferimento prima di confrontare le tecniche

Il dossier di scelta dovrebbe identificare prodotto, formulazione, presentazione, mercato, metodo registrato o approvato e versione del testo utilizzato. È una proposta organizzativa GuideGxP per evitare che la parola «compendiale» nasconda riferimenti diversi. La disponibilità di una procedura interna storica non garantisce che questa rifletta ancora formulazione e condizioni correnti.

ICH Q4B Annex 8 tratta l’intercambiabilità dei capitoli Ph. Eur. 2.6.1, USP <71> e JP 4.06 entro condizioni specificate e con attuazione regionale. Non autorizza una sostituzione indiscriminata né elimina la necessità di dimostrare l’idoneità per il prodotto. Le condizioni di prova dei dispositivi medici sono fuori dal campo della raccomandazione ICH citata. [2]

Per i principi tecnici qui illustrati è stato letto il capitolo WHO della Farmacopea Internazionale, 13ª edizione 2025. I testi integrali correnti a licenza di USP e Ph. Eur. non sono stati consultati: il laboratorio deve verificarli quando applicabili. La fonte WHO aiuta a comprendere il ragionamento; non viene dichiarata automaticamente equivalente al metodo autorizzato per ogni prodotto.

3. Filtrazione: separare il campione senza perdere la capacità di rilevazione

Nella filtrazione, il sistema trattiene sulla membrana i microrganismi presenti nella porzione esaminata, mentre il liquido attraversa il filtro. La membrana viene poi posta nelle condizioni di coltura previste, mediante trasferimento asettico o introduzione del terreno nel sistema compatibile. Il capitolo WHO richiede una membrana con capacità di ritenzione stabilita e un’apparecchiatura che consenta le operazioni in condizioni asettiche. [1]

Il possibile vantaggio è separare il materiale trattenuto da componenti della matrice che ostacolerebbero la crescita, mediante il trattamento previsto e dimostrato idoneo. Non significa che qualsiasi residuo venga eliminato. Membrana, diluente, eventuali sostanze neutralizzanti e condizioni di lavaggio appartengono al metodo da verificare, non a un elenco di accessori liberamente intercambiabili.

Valuta la filtrabilità del prodotto nella preparazione realmente prevista, la compatibilità con materiali e solventi, la quantità da esaminare e la praticabilità del percorso. Una difficoltà di passaggio non si risolve automaticamente aumentando pressione, diluizione o lavaggi. Occorre rispettare i vincoli compendiali e dimostrare che la modifica non comprometta la prova. Nel testo WHO anche i lavaggi hanno limiti: «lavare di più» non è una soluzione universale all’inibizione. [1]

La categoria commerciale della formulazione non decide da sola. Il testo WHO contempla anche preparazioni oleose o solubili in solventi appropriati, sotto condizioni definite. Perciò «prodotto oleoso uguale inoculo diretto» è una conclusione troppo rapida. Il dossier dovrebbe distinguere una reale incompatibilità dalla semplice assenza di dati sulla configurazione considerata.

4. Inoculo diretto: controllare ciò che rimane nel terreno

Nell’inoculo diretto, la porzione prevista di prodotto viene introdotta nel terreno di coltura. La matrice rimane quindi parte del sistema di prova e può influenzare sia la crescita sia la possibilità di osservarla. La tecnica può essere pertinente quando la filtrazione non è praticabile o secondo il metodo applicabile, ma richiede un esame esplicito di questi effetti. [1]

Occorre valutare attività antimicrobica, interazione prodotto-terreno, diluizione o neutralizzazione ammesse e comportamento della miscela durante la lettura. Un controllo positivo senza prodotto mostra una proprietà del terreno e delle condizioni di controllo; da solo non dimostra che la stessa crescita sia rilevabile in presenza del campione.

La torbidità propria della formulazione può impedire di distinguere una variazione attribuibile alla crescita. Non è corretto trasformare una lettura non interpretabile in un risultato negativo. Il metodo deve prevedere il trattamento applicabile a tale situazione e le evidenze da registrare. Non si aggiungono passaggi improvvisati al termine della prova soltanto per ottenere una lettura conveniente. [1]

Il confronto organizzativo deve considerare anche contenitori, ingombro, manipolazioni e capacità di incubazione nelle condizioni richieste. Questi fattori rendono una soluzione praticabile, ma non prevalgono sull’idoneità del metodo. Un percorso più semplice per l’operatore non è necessariamente più informativo sul prodotto.

5. Idoneità del metodo: dimostrare l’assenza di interferenze rilevanti

Lo studio di idoneità mette alla prova la capacità del metodo di rivelare i microrganismi di riferimento nelle condizioni previste, inclusa la presenza del prodotto o il suo trattamento. Il confronto con il controllo pertinente senza prodotto permette di valutare se l’attività antimicrobica sia assente o sia stata adeguatamente eliminata. Non basta allegare una dichiarazione generica sul materiale filtrante. [1,2]

Definisci quali caratteristiche della matrice potrebbero ostacolare la prova e quali parti dello studio rispondano a ciascun dubbio. Registra composizione o variante rappresentata, preparazione, sistema, materiali, terreni, controlli, osservazioni ed eventuali modifiche. La proposta GuideGxP è mantenere una corrispondenza leggibile tra rischio ipotizzato, prova effettuata ed evidenza ottenuta.

Se la crescita attesa non è dimostrata nelle condizioni richieste, il metodo non diventa idoneo perché il campione ordinario non mostra crescita. L’interferenza deve essere affrontata e l’idoneità rivalutata secondo il riferimento applicabile. Il testo WHO prevede tale verifica per un nuovo prodotto e quando cambiano le condizioni sperimentali. Non estendere una conclusione a matrici differenti senza una giustificazione adeguata. [1]

Distingui inoltre promozione della crescita del terreno, idoneità del metodo e risultato del test sul prodotto. Sono evidenze collegate, ma rispondono a domande diverse. Una documentazione che le chiama tutte «controllo positivo» rende difficile capire che cosa sia stato realmente verificato.

6. Matrice originale per motivare la scelta

La tabella è uno strumento GuideGxP, non una graduatoria normativa. Per ogni riga annota il riferimento applicabile, l’evidenza disponibile e il dubbio ancora aperto. Se una condizione critica non è risolta, la scelta rimane una proposta da verificare.

Una decisione utile non si limita a «membrana preferita». Precisa per quale prodotto, configurazione e metodo valga; quali alternative siano state considerate; chi abbia valutato i dati; quali condizioni richiedano un nuovo riesame. Le caselle prive di evidenza devono rimanere visibili, non essere riempite con un giudizio di conformità non dimostrato.

7. Due matrici simulate, due ragionamenti

Caso A, soluzione acquosa limpida con componente potenzialmente inibente. Il laboratorio considera la filtrazione perché la preparazione appare compatibile con tale percorso. La limpidezza non dimostra però assenza di attività antimicrobica. Il piano verifica sistema e materiali, trattamento consentito e idoneità nelle condizioni finali. La decisione favorevole rimane subordinata ai risultati di queste verifiche, non alla sola facilità di filtrazione.

Se durante lo studio emerge inibizione residua, il gruppo documenta il problema e valuta modifiche consentite con nuova dimostrazione di idoneità. Non continua ad aumentare i lavaggi senza limite e non passa all’inoculo diretto supponendo che questo elimini il medesimo problema. La matrice decisionale evidenzia quale condizione non sia ancora soddisfatta.

Caso B, sospensione viscosa e opaca. Nel secondo caso simulato il laboratorio raccoglie evidenze che la preparazione prevista non sia filtrabile nella configurazione valutata. Considera quindi l’inoculo diretto nel quadro del metodo applicabile. Rimangono due domande separate: la matrice inibisce la crescita e la sua opacità impedisce una lettura affidabile?

Il piano affronta entrambe con le verifiche di idoneità e il percorso di osservazione ammesso dal riferimento. La disponibilità di incubatori più capienti non chiude tali dubbi. Se la lettura resta non interpretabile, la proposta non è pronta per l’impiego ordinario. I casi non dimostrano prestazioni sperimentali e non prescrivono una tecnica a tutte le soluzioni o sospensioni.

8. Rendere ricostruibile la prova

Prima dell’uso ordinario, collega metodo approvato, evidenze di idoneità, competenza del personale e stato delle apparecchiature. Verifica identificazione e stato di terreni, diluenti e materiali, non soltanto la loro presenza sul banco. Le buone pratiche WHO per i laboratori microbiologici sostengono questa gestione coordinata di risorse, attività e registrazioni. [4]

Le registrazioni dovrebbero permettere di ricostruire quale campione sia stato esaminato, da chi, con quali materiali e condizioni, quali controlli siano stati eseguiti e quali osservazioni abbiano portato al risultato. Per i sistemi elettronici conserva dati originali e contesto necessario; una trascrizione finale «conforme» non descrive gli eventi della prova.

L’Annex 1 richiede condizioni asettiche e controllo dei terreni secondo il riferimento pertinente. Richiede inoltre che la decontaminazione delle superfici esterne dei campioni non comprometta sensibilità del metodo o affidabilità del campione. Un trattamento protettivo per l’ambiente non deve quindi essere assunto innocuo per la prova senza valutazione. [3]

Come controllo operativo originale, chiedi al revisore di ricostruire una prova a partire dai record conservati: identità, versione del metodo, materiali, condizioni, controlli, osservazioni, anomalie e decisione. Se una di queste connessioni dipende soltanto dalla memoria dell’analista, identifica la lacuna documentale prima che diventi un problema d’indagine.

9. Risultati dubbi o positivi: preservare prima di concludere

Un’osservazione dubbia richiede registrazione e gestione secondo la procedura approvata. Conserva le evidenze pertinenti, informa le funzioni responsabili e distingui dato osservato, ipotesi e conclusione. Non trasformare automaticamente torbidità, difficoltà di lettura o anomalia di controllo in «errore di laboratorio».

Il capitolo WHO considera la crescita un esito non conforme al test salvo dimostrazione chiara dell’invalidità per cause estranee al prodotto secondo le condizioni previste. Un retest negativo non cancella da solo il risultato iniziale. L’indagine deve valutare dati di prova e controlli, ambiente, procedura e informazioni pertinenti sul microrganismo senza selezionare soltanto gli elementi favorevoli. [1]

La decisione su invalidazione, ulteriori prove e impatto sul prodotto appartiene al processo qualità applicabile. Questo articolo non fornisce criteri alternativi di rilascio. La scelta iniziale del metodo è utile anche qui: un dossier completo consente di capire se una difficoltà era stata prevista, quali evidenze la coprivano e che cosa sia cambiato.

Conclusione operativa

Scegli la tecnica partendo dal prodotto e dal riferimento applicabile, poi dimostra che la configurazione mantenga rilevazione e interpretabilità. Documenta interferenze, controlli e confini della conclusione. Se manca un’evidenza critica, rendi esplicito il dubbio e risolvilo prima dell’impiego ordinario: la disponibilità di un sistema non è ancora una motivazione del metodo.

Prosegui nell’HUB Microbiologia e sterilità e nel percorso sull’organizzazione del laboratorio microbiologico, per collegare la scelta ai flussi e alle risorse reali.

Fonti e applicabilità

Verifica fonti: 30 settembre 2026. WHO 13ª edizione 2025 consultata integralmente per questo capitolo; ICH Q4B Annex 8 Step 5 e sezioni pertinenti Annex 1 lette. USP pubblico consultato soltanto come preview; testo integrale corrente USP/Ph. Eur. da verificare dal laboratorio. La matrice, i casi e le domande di riesame sono raccomandazioni originali GuideGxP, non requisiti compendiali aggiuntivi.

1. WHO — The International Pharmacopoeia, 3.2 Test for sterility. 13ª edizione, 2025.
2. EMA / ICH — Q4B Annex 8, Sterility Test. Step 5, EMA/CHMP/ICH/645592/2008; documento 2017, applicazione da dicembre 2009.
3. European Commission — EU GMP Annex 1. Revisione 2022, in particolare 10.5–10.9.
4. WHO — Good practices for pharmaceutical microbiology laboratories. TRS 961, Annex 2, 2011.
5. USP — General Chapter <71> Sterility Tests. Preview pubblico, citazione 2017; non consultazione integrale dell’edizione corrente.