USP <61> e <62> sono i due capitoli della Farmacopea Statunitense che regolano l'esame microbiologico dei prodotti non sterili: il primo definisce i test di enumerazione (TAMC e TYMC), il secondo la ricerca dei microrganismi specificati. In laboratorio vengono spesso citati insieme, ma rispondono a due domande diverse: "quanti microrganismi ci sono?" e "ci sono microrganismi inaccettabili per questa via di somministrazione?". Confonderli — o applicarne uno solo quando la monografia li richiede entrambi — è una delle cause più frequenti di specifiche incomplete e di rilievi in audit. In questa guida mettiamo i due capitoli a confronto, con i requisiti operativi di ciascuno e gli errori da evitare.
USP <61> e <62>: due capitoli, un unico sistema
I due capitoli nascono per essere usati in coppia e sono armonizzati tramite il Pharmacopeial Discussion Group (PDG) con la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 2.6.12 e 2.6.13) e con la Farmacopea Giapponese: un metodo conforme a USP <61>/<62> è quindi sovrapponibile ai capitoli europei equivalenti, un vantaggio concreto per i siti che rilasciano su più mercati. Il terzo elemento del sistema è USP <1111>, il capitolo informativo che fissa i criteri di accettazione per forma farmaceutica: <61> e <62> dicono come si esegue il test, <1111> dice quale risultato è accettabile.
| Aspetto | USP <61> | USP <62> |
|---|---|---|
| Domanda a cui risponde | Quanti microrganismi vitali contiene il prodotto (conta quantitativa) | Sono presenti microrganismi specificati "objectionable" (esito qualitativo: presenza/assenza) |
| Output del test | TAMC e TYMC in CFU/g o CFU/mL | Assenza (o presenza) del microrganismo target nella quantità di campione definita |
| Metodi previsti | Filtrazione su membrana, pour plate, spread plate, MPN | Arricchimento in brodo seguito da isolamento su terreni selettivi |
| Terreni principali | Soybean–Casein Digest Agar (TAMC), Sabouraud Dextrose Agar (TYMC) | Terreni selettivi dedicati: MacConkey, XLD, Cetrimide, Mannitol Salt, VRBG, Columbia |
| Incubazione | TAMC: 30–35 °C per 3–5 giorni; TYMC: 20–25 °C per 5–7 giorni | Variabile per target (es. arricchimento E. coli in MacConkey Broth a 42–44 °C) |
| Uso tipico | Specifiche di rilascio e stabilità, monitoraggio materie prime | Conformità ai requisiti per via di somministrazione secondo <1111> |
USP <61>: enumerazione microbica (TAMC e TYMC)
Il capitolo <61> misura la carica microbica totale attraverso due conte distinte: il Total Aerobic Microbial Count (TAMC) su Soybean–Casein Digest Agar, incubato a 30–35 °C per 3–5 giorni, e il Total Combined Yeasts and Molds Count (TYMC) su Sabouraud Dextrose Agar, incubato a 20–25 °C per 5–7 giorni. Il laboratorio sceglie tra filtrazione su membrana, pour plate, spread plate o Most Probable Number (MPN) in funzione della natura del campione e del limite da verificare: la filtrazione su membrana è preferibile quando il limite è basso o il prodotto ha attività antimicrobica rimovibile con i risciacqui, mentre l'MPN è riservato ai casi in cui gli altri metodi non sono applicabili.
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USP <62>: la ricerca dei microrganismi specificati
Il capitolo <62> non conta: cerca. La logica è arricchimento in brodo non selettivo o selettivo, seguito da subcultura su terreno selettivo e conferma dell'identità. I target previsti dal capitolo sono:
- Batteri Gram-negativi bile-tolleranti — arricchimento in Enterobacteria Enrichment Broth Mossel, isolamento su Violet Red Bile Glucose Agar;
- Escherichia coli — arricchimento in MacConkey Broth a 42–44 °C, isolamento su MacConkey Agar;
- Salmonella — su almeno 10 g di prodotto, con Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth e Xylose Lysine Deoxycholate Agar;
- Pseudomonas aeruginosa — isolamento su Cetrimide Agar;
- Staphylococcus aureus — isolamento su Mannitol Salt Agar;
- Clostridi — Reinforced Medium for Clostridia e Columbia Agar in anaerobiosi;
- Candida albicans — Sabouraud Dextrose Broth e Sabouraud Dextrose Agar.
Quali di questi target testare non lo decide il laboratorio: lo decidono la monografia del prodotto e i requisiti per via di somministrazione. Un prodotto orale acquoso richiede tipicamente l'assenza di E. coli; un topico l'assenza di S. aureus e P. aeruginosa; un rettale, di norma, nessun microrganismo specificato.
Suitability del metodo: il punto dove si fallisce
Entrambi i capitoli richiedono la dimostrazione di idoneità del metodo in presenza del prodotto, ed è qui che si concentrano i finding. I requisiti chiave sono tre. Primo: l'inoculo dei ceppi di riferimento non deve superare 100 CFU, con ceppi inoculati singolarmente e mai in miscela. I ceppi indicati dal capitolo armonizzato includono S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 9027, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans ATCC 10231 e A. brasiliensis ATCC 16404 (o equivalenti di altre collezioni riconosciute come NCIMB, CIP, NBRC). Secondo: per <61> il recupero in presenza del prodotto non deve differire di un fattore superiore a 2 dal controllo senza prodotto; se il prodotto inibisce, vanno applicati neutralizzanti, diluizioni o filtrazione con risciacqui, e la scelta va documentata. Terzo: un controllo negativo deve accompagnare ogni esecuzione del test per dimostrare l'assenza di contaminazioni della procedura. Una suitability eseguita una sola volta e mai rivalutata dopo cambi di formulazione è un classico rilievo: il razionale della validità nel tempo deve essere scritto, non presunto.
Criteri di accettazione: il ruolo di USP <1111>
I risultati di <61> e <62> si interpretano con i criteri di USP <1111>, armonizzato con Ph. Eur. 5.1.4. Per le forme orali acquose il riferimento tipico è TAMC 102 CFU/g o mL e TYMC 101, con assenza di E. coli in 1 g o mL; per le orali non acquose TAMC 103 e TYMC 102; per le vie cutanea, nasale e auricolare TAMC 102 e TYMC 101 con assenza di S. aureus e P. aeruginosa; per la via inalatoria si aggiunge l'assenza di Gram-negativi bile-tolleranti. Attenzione all'interpretazione dei limiti, spesso sbagliata nelle SOP: un criterio di 102 CFU corrisponde a un massimo accettabile di 200 CFU, non di 100, perché il capitolo ammette la variabilità intrinseca del metodo di conta. E il rispetto dei limiti di <1111> non esaurisce il tema: la valutazione dei microrganismi "objectionable" per prodotto, processo e paziente resta una responsabilità del produttore, come la FDA ricorda sistematicamente nelle ispezioni sui non sterili.
Raccomandazione GuideGxP
Nelle specifiche e nelle SOP, tratta <61> e <62> come un sistema unico: specifica di prodotto che cita TAMC, TYMC e i microrganismi specificati con la quantità di campione; suitability documentata per ciascuna matrice, con razionale di rivalutazione a ogni cambio di formulazione o fornitore; interpretazione dei limiti scritta nero su bianco (102 = massimo 200 CFU) per evitare OOS dichiarati per eccesso di zelo; e un razionale documentato sugli objectionable organisms oltre i target di <62>. In audit, la domanda non sarà "esegui il test?" ma "perché il tuo metodo è idoneo per questo prodotto?".
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