Biofilm y rouging en sistemas de agua farmacéutica: investigación y recuperación

La tercera superación de alert level en seis meses en el mismo point of use del loop de Purified Water se cerró igual que las dos anteriores: resultado aislado, remuestreo conforme, operador reentrenado en la técnica de toma de muestra. Ninguna de las tres investigaciones miró a las otras dos. En inspección la pregunta llegó en menos de un minuto: enséñenme la tendencia de ese punto en los últimos dos años. El gráfico no mostraba tres picos aislados, sino una línea base que se había desplazado lentamente hacia arriba, con los picos apoyados encima. No era un problema de muestreo: era un sistema que estaba cediendo.

El Anexo 1 de EudraLex Volumen 4 (C(2022) 5938 final, en operación desde el 25 de agosto de 2023) pide exactamente esa distinción: en el punto 6.14, las superaciones de alert level deben documentarse, revisarse e investigarse, y la investigación debe establecer si se trata de un evento aislado o de una tendencia adversa o un deterioro del sistema. Frase breve, consecuencias pesadas: si la conclusión es «evento aislado», hay que demostrarla, no asumirla porque el remuestreo volvió a estar dentro de límites.

Detrás de la mayoría de las superaciones recurrentes hay dos fenómenos distintos: el biofilm y el rouging. Confundirlos produce dos errores simétricos: sanitizar un sistema que tiene un problema de corrosión, y repasivar un sistema que tiene un problema microbiológico. Lo que sigue es el recorrido de investigación que permite distinguirlos, caracterizarlos y decidir una intervención proporcionada, dentro del marco de diseño, cualificación y gestión del ciclo de vida de los sistemas de agua farmacéutica.

Dos fenómenos que el muestreo tiende a confundir

El biofilm es una comunidad de microorganismos sésiles adheridos a la superficie interna del sistema y embebidos en una matriz polimérica extracelular que ellos mismos producen. Esa matriz no es un detalle: es una barrera que frena la penetración de los agentes sanitizantes, alberga microambientes distintos del bulk y retiene nutrientes. La muestra de agua mide por construcción la fase planctónica, que ante un biofilm maduro se alimenta de desprendimientos intermitentes y no de un crecimiento homogéneo. De ahí la firma típica de la superación por biofilm: resultados que oscilan, remuestreos conformes horas después y una deriva lenta de la línea base visible solo en la tendencia larga. El PDA Technical Report No. 69 (2015), sobre la gestión de biocarga y biofilm en operaciones farmacéuticas, señala precisamente los sistemas que mueven fluidos como el escenario donde el biofilm más pesa.

El rouging, en cambio, afecta a la superficie del acero inoxidable: formación o deposición de óxidos e hidróxidos con hierro sobre la capa pasiva. No es una única enfermedad con una única cura. Puede originarse en otro punto del sistema y ser transportado y redepositado por el fluido; puede desarrollarse in situ donde la capa pasiva está localmente debilitada; puede adoptar las formas estables y adherentes típicas de superficies expuestas largo tiempo a alta temperatura. La literatura técnica describe habitualmente estas formas con una tripartición en «tipos». Conviene decirlo con claridad: esa tripartición es una convención de literatura técnica, útil para ordenar la observación, y no una clasificación normativa. Ninguna farmacopea, ningún anexo GMP y ninguna norma citada aquí define categorías regulatorias de rouge.

Ambos fenómenos interactúan: una superficie irregular o con depósitos adherentes ofrece puntos de anclaje a la adhesión microbiana, y un biofilm consolidado genera gradientes locales de oxígeno y pH que pueden contribuir al ataque de la capa pasiva. Coexistir no los convierte en el mismo problema: las acciones correctivas y las verificaciones de eficacia se apoyan en evidencias distintas.

Antes de la hipótesis: descartar los artefactos

La primera pregunta no es «qué hay en el sistema» sino «el dato es real». Cerrar una superación atribuyéndola a un artefacto sin demostrarlo es un defecto grave; no buscar el artefacto lo es igualmente, porque lleva a desmontar un sistema sano. La secuencia es documental antes que física, y debe cerrarse pronto porque muchas evidencias son perecederas.

La identificación del aislado es la herramienta más infrautilizada de esta fase. Un organismo asociado a la manipulación humana, aparecido una sola vez en un punto poco usado y con controles de laboratorio limpios, cuenta una historia distinta de la de un organismo hidrófilo recurrente que aparece en puntos diferentes del mismo ramal. La disciplina de muestreo y la justificación de los puntos se tratan en el artículo sobre planes de muestreo y puntos de muestreo; los métodos de recuento e identificación, en el de control microbiológico y de endotoxinas en PW y WFI.

Leer la tendencia antes que el dato aislado

El Anexo 1 6.13 exige monitorización química y microbiológica regular y continuada, con alert levels basados en los datos de cualificación inicial y reexaminados periódicamente a la luz de la recualificación, la monitorización de rutina y las investigaciones; el 6.14 exige distinguir entre evento aislado y tendencia adversa. Juntas, ambas cláusulas implican que un dato aislado no es interpretable por sí solo.

Una tendencia útil a este fin está estratificada por punto y no agregada sobre el loop, porque la media del sistema esconde el punto que empeora. Cubre un horizonte suficiente para captar la variación estacional, que el Anexo 1 6.8 pide considerar en la cualificación de los sistemas de agua y para la que el Q&A de la EMA sobre métodos no destilativos (EMA/INS/GMP/443117/2017) espera, en la fase inicial, datos de aproximadamente un año. Considera los resultados no conformes y los conformes pero en ascenso, porque la deriva de la línea base es la señal temprana. E incluye los eventos no microbiológicos: sanitizaciones realizadas y omitidas, mantenimientos, sustituciones, paradas, cambios aprobados.

El punto más delicado son los límites. Cuando un sistema deriva, la tentación es revisar alert y action level «sobre la base de los datos históricos recientes». La EMA es explícita: increasing of such limits is not good practice and may mask a failing system. La revisión periódica prevista en el Anexo 1 6.13 sirve para hacer los niveles más representativos de la capability del sistema cualificado, no para perseguir hacia arriba un sistema que se degrada. USP <1231>, capítulo informativo y por tanto no vinculante, indica niveles de acción de referencia y deja a los usuarios establecer especificaciones internas: esa libertad es justamente lo que hace obligatoria una justificación documentada cuando los niveles cambian.

Interrogar al sistema: las condiciones que hacen posible el biofilm

Si el dato se sostiene y la tendencia indica un problema real, la investigación pasa a las condiciones operativas. El biofilm no es un accidente: es el resultado previsible de superficie, hidráulica, temperatura, nutrientes y tiempo.

• ¿El flujo ha seguido siendo turbulento en todas partes? El Anexo 1 6.9 exige que el flujo se mantenga turbulento para limitar la adhesión microbiana y la formación de biofilm, y que el caudal establecido en cualificación se monitorice de rutina. A verificar: caudal real frente al cualificado, comportamiento en los ramales, degradación de la bomba, points of use añadidos después de la cualificación.
• ¿Se ha mantenido la temperatura de operación? En los sistemas calientes cuenta la temperatura efectiva en cada tramo, no la del depósito; el Anexo 1 6.10 cita como ejemplo, para el WFI, la circulación constante por encima de 70 grados Celsius. En los sistemas a temperatura ambiente el margen es más estrecho: el Q&A de la EMA recuerda que las unidades de RO operan típicamente a temperatura ambiente y constituyen por ello un ambiente ideal para la formación de biofilm. La elección entre sistemas calientes, fríos y ozonizados determina qué estrategia de control está realmente disponible.
• ¿Hay zonas muertas nuevas? El Anexo 1 6.7 exige pendiente de las tuberías para el drenaje y evitar los dead legs. Los que cuentan en las investigaciones rara vez son los de proyecto: son ramales de points of use dados de baja pero no retirados, instrumentos sobre derivaciones, racores para usos temporales. Geometría y materiales se tratan en el artículo sobre dead legs, pendientes, materiales e hygienic design.
• ¿Las sanitizaciones se ejecutaron tal como están cualificadas? El Anexo 1 6.12 prevé esterilización, desinfección o regeneración según un calendario predeterminado y como acción remedial tras resultados fuera de límite o fuera de especificación. A verificar: ciclos retrasados u omitidos, parámetros alcanzados en cada punto y no solo en el punto de control, puntos excluidos, válvulas no maniobradas.
• ¿Qué ha cambiado aguas arriba? Agua de alimentación, pretratamiento, regeneraciones, cambios de membrana, filtros de venteo del depósito: el Anexo 1 6.11 exige que los filtros de venteo hidrófobos retenedores de bacterias no sean fuente de contaminación, con test de integridad antes de la instalación y después del uso, y prevención de la condensación.

La inspección física: cuándo se abre el sistema

El sistema se abre cuando la evidencia documental ha reducido el campo a una porción de la instalación, o cuando la tendencia indica un deterioro que los datos de proceso no explican. Abrir es en sí un evento contaminante: secuencia definida, puntos fotografiados y mapeados, muestras de superficie y de depósito tomadas antes de cualquier limpieza, con restitución y sanitización cualificadas ya previstas en el plan.

Lo primero que hay que mirar es donde se concentra la evidencia: interfase líquido-vapor en el depósito, zonas de sombra del spray pattern, válvulas de los points of use y sus asientos, intercambiadores, juntas y uniones, tramos terminales de los ramales, superficies aguas abajo de defectos de soldadura. Donde no hay acceso directo, la inspección endoscópica de tramos seleccionados suele ser la única forma de obtener evidencia sin cortar. Para las unidades de membrana, el Q&A de la EMA menciona explícitamente el análisis destructivo de la membrana como medio para confirmar la ausencia de biofilm: evidencia fuerte y no repetible, que debe decidirse con criterios fijados de antemano y leerse junto con el historial de esa membrana, no como veredicto sobre todo el sistema.

Rouging: caracterizar antes de decidir

Cuando aparece una coloración anómala, la reacción instintiva es planificar una repasivación. Es equivocada, porque salta la fase que determina si hace falta una intervención y cuál. No todo rouging exige una repasivación. Algunos son estables y no progresivos, algunos no liberan partículas en condiciones operativas, algunos son la consecuencia visible de una causa aguas arriba que hay que eliminar antes e independientemente de cualquier tratamiento superficial.

• Extensión y localización. Un fenómeno difuso, uno localizado aguas abajo de un componente y uno confinado a la zona más caliente cuentan historias distintas.
• Aspecto y adherencia. Depósito retirable o película adherente y continua; color y uniformidad; ataque visible del sustrato.
• Naturaleza del depósito. Análisis elemental y morfológico sobre muestra tomada de forma trazable, para distinguir material transportado y redepositado de una oxidación desarrollada in situ.
• Progresión en el tiempo. Comparación con inspecciones previas, fotografías fechadas, historial de sanitizaciones, edad del sistema y del componente.
• Impacto medible. Parámetros controlados, partículas donde se monitorizan, evidencia de liberación hacia el producto.
• Historia constructiva. Materiales y acabado superficial, tratamiento de las soldaduras, pasivación inicial documentada, modificaciones posteriores. ASME BPE trata materiales metálicos, acabados superficiales y system design en partes dedicadas: la edición aplicable debe fijarse contractualmente y los criterios numéricos leerse en esa edición, no de memoria.

El resultado no es una etiqueta, sino la respuesta a tres preguntas: ¿el fenómeno progresa?; ¿afecta a la calidad del agua o del producto?; ¿hay una causa activa que seguirá actuando incluso después de tratar la superficie?

La decisión de repasivar no es automática

La repasivación es una intervención química sobre una instalación en servicio, con riesgos propios: ataque a juntas y componentes no metálicos, daño a la instrumentación, enjuague incompleto, efluentes que gestionar, parada de producción y necesidad de recualificar antes de volver a servicio. El marco técnico lo dan ASTM A967/A967M-25 para la pasivación química del acero inoxidable y ASTM A380/A380M-25 para cleaning, descaling, pickling y pasivación: ambos definen prácticas y verificaciones, no el cuándo intervenir en un sistema dado. Esa decisión es de la planta, con el marco de gestión del riesgo de ICH Q9(R1) y la lógica de gestión de acciones de ICH Q10. La matriz siguiente se entrega con la columna de pesos vacía: los pesos los asigna la planta según el producto, la criticidad de uso del agua y la configuración de la instalación.

Las opciones no son dos. Entre «no hacer nada» y «repasivar todo el sistema» están la vigilancia instrumentada con criterios de reexamen definidos, el tratamiento solo del tramo afectado, la sustitución del componente y la corrección de la causa aguas arriba. Si se interviene, hacen falta un plan de verificación definido de antemano y una recualificación proporcionada: una repasivación no verificada desplaza el problema, no lo cierra.

Remediación del biofilm: por qué una shock sanitisation no cierra el caso

El Anexo 1 6.12 reconoce la sanitización como acción remedial tras resultados fuera de límite o fuera de especificación, y es la respuesta correcta como primera intervención. No es correcto, sin embargo, afirmar que una shock sanitisation elimine definitivamente un biofilm maduro. Las razones son mecánicas, no teóricas.

La primera es la penetración: la matriz frena la difusión del agente y consume parte de él por reacción, de modo que la concentración que alcanza las capas profundas puede ser sensiblemente inferior a la del bulk y el tiempo de contacto necesario difiere del suficiente para células planctónicas. La segunda es la distribución: el ciclo alcanza el sistema de forma heterogénea, y los puntos de baja velocidad, los ramales terminales, los asientos de válvula y las zonas de sombra reciben menos de lo que indica el punto de control. La tercera es que matar no equivale a eliminar: una matriz inactivada pero no eliminada sigue siendo una superficie acondicionada, ideal para la recolonización, y puede seguir liberando materia orgánica y endotoxinas. La cuarta es la supervivencia de fracciones residuales en nichos protegidos, suficientes para reiniciar la colonización.

De ahí tres consecuencias operativas. Una remediación eficaz combina eliminación e inactivación y no se agota en un único tratamiento. Si el ciclo cualificado no bastó, la acción no es repetirlo idéntico indefinidamente, sino revisar sus parámetros y su cualificación: el artículo sobre la cualificación de los ciclos de sanitización trata cómo se demuestra esa adecuación. Y es la eliminación de la causa la que decide el desenlace: si la velocidad sigue baja, el dead leg sigue en su sitio o la temperatura sigue fuera del perfil cualificado, la recolonización es solo cuestión de tiempo. El Q&A de la EMA menciona el tratamiento térmico por encima de 75 grados Celsius como enfoque de control del biofilm en sistemas no destilativos, dejando los tiempos de contacto a la validación del fabricante: confirmación de que los parámetros eficaces deben establecerse y demostrarse sobre el sistema concreto.

Verificar la recuperación: evidencia en el tiempo, no un resultado conforme

El resultado conforme aislado tras la sanitización es la evidencia más débil disponible, porque es el comportamiento esperado incluso cuando el biofilm solo ha sido perturbado. La verificación de la recuperación es un plan aprobado antes de la intervención, que establece qué puntos muestrear y con qué frecuencia aumentada, cuánto tiempo mantener el régimen intensificado, qué parámetros físicos seguir en paralelo, qué criterio cuantitativo define la recuperación y qué evidencia autoriza el retorno a la rutina.

Ninguna de las fuentes citadas fija ese criterio, esa duración ni ese número de muestras: deben establecerse, justificarse y documentarse por la planta, sobre elementos verificables como la capability demostrada en la cualificación inicial, la variabilidad histórica del sistema bajo control, el horizonte en el que la recolonización se ha manifestado históricamente en ese sistema, la variación estacional y la criticidad de uso del agua. Un criterio robusto mira la distribución de los resultados y la estabilidad de la línea base en lugar de un valor aislado, considera varios puntos del ramal afectado y prevé qué hacer si la deriva se reanuda tras el retorno a la rutina.

En la misma lógica entra la monitorización continua que el Anexo 1 6.15 exige para los sistemas WFI, como TOC y conductividad: en fase de recuperación esas señales, leídas junto con el dato microbiológico, dan continuidad a una evidencia que de otro modo es discreta. El Q&A de la EMA establece además, como mínimo, una evaluación anual de la eficacia de la monitorización: tras un evento de este tipo, ahí es donde se comprueba si el plan habría podido interceptar antes la deriva.

CAPA: cerrar sobre la causa, no sobre el evento

ICH Q10 sitúa las acciones correctivas y preventivas entre los elementos del sistema de calidad farmacéutico, e ICH Q9(R1) aporta el marco de riesgo que gobierna su proporcionalidad. La root cause analysis debe llegar a una causa que explique el pattern, no solo el último resultado: si la tendencia muestra tres superaciones en seis meses en el mismo ramal, la causa debe explicar por qué ese ramal y por qué esa cadencia. Corrección, acción correctiva y acción preventiva se trazan por separado: sanitizar es la corrección; eliminar el dead leg, restablecer el caudal cualificado, revisar el ciclo o sustituir el componente son acciones correctivas; extender la verificación a los ramales con la misma configuración, actualizar el plan de muestreo e introducir una regla de trending que detecte la deriva antes del action level son acciones preventivas. La eficacia se verifica con la evidencia definida en el plan de recuperación: la CAPA no se cierra antes de que esa evidencia exista.

Ejemplo aplicativo: Planta Delta

Planta Delta es un ejemplo didáctico, no un caso real. Fabrica formas no estériles y opera un loop de PW a temperatura ambiente con sanitización química periódica. En doce meses registra cuatro superaciones de alert, tres de ellas en dos points of use contiguos del mismo ramal terminal; las dos primeras se habían cerrado como error de muestreo.

Reabierta la investigación, la revisión documental no encuentra artefactos: técnica de toma correcta, controles de laboratorio limpios, aislado recurrente compatible con la flora hidrófila del sistema. La tendencia por punto muestra que los dos puntos tienen una línea base más alta que el resto desde hace unos nueve meses, con el inicio de la deriva justo después de una intervención de mantenimiento. La revisión de las condiciones operativas revela que tras esa intervención un point of use aguas abajo se dio de baja sin retirar el ramal, y que el caudal del ramal terminal no se verificaba por separado del de loop. La inspección endoscópica confirma un depósito continuo en el ramal excluido.

Las acciones: sanitización como corrección inmediata; retirada física del ramal dado de baja y restitución de la configuración cualificada; revisión del ciclo con verificación de los parámetros alcanzados también en los ramales terminales; monitorización intensificada según un plan de recuperación aprobado antes de la intervención, con criterios y duración justificados sobre los datos históricos; extensión de la verificación a los ramales análogos; regla de trending por punto que señale la deriva antes de superar el action level. Se observa además una coloración superficial localizada: se documenta, se muestrea y se incorpora al programa de vigilancia con criterios de reexamen definidos. No se planifica una repasivación, porque la caracterización no muestra progresión ni impacto en los parámetros controlados: una decisión que hay que documentar y reexaminar, no un caso cerrado.

Checklist de investigación

1. El resultado está confirmado, o existe evidencia documentada de artefacto de toma, transporte o laboratorio; el aislado está identificado al nivel establecido por la planta y comparado con la flora típica del sistema y del laboratorio.
2. La tendencia se ha reexaminado por punto, sobre un horizonte que cubre la variación estacional, incluyendo los resultados conformes.
3. Se han correlacionado caudal, temperatura, TOC, conductividad, alarmas, mantenimientos, cambios y sanitizaciones realizadas u omitidas, verificando las condiciones cualificadas en el tramo afectado y comparando la configuración actual con la cualificada.
4. La inspección física está planificada con secuencia, muestreo del depósito antes de la limpieza, restitución y sanitización cualificadas; cualquier coloración superficial se caracteriza por extensión, adherencia, naturaleza, progresión e impacto antes de cualquier decisión.
5. El plan de verificación de la recuperación está aprobado antes de la intervención, con criterios, puntos, frecuencia y duración justificados.
6. La CAPA distingue corrección, acción correctiva y acción preventiva, y se cierra solo tras la verificación de eficacia.

Errores frecuentes y red flags

• Cerrar repetidamente superaciones como «eventos aislados» sin reexaminar las anteriores: es el pattern que el Anexo 1 6.14 pide descartar y resulta evidente para cualquiera que mire la tendencia.
• Atribuir la superación a un error de muestreo sin evidencia documental, usando el remuestreo conforme como prueba.
• Subir alert y action level para realinearlos con los datos recientes de un sistema en deriva.
• Declarar resuelto un problema de biofilm sobre la base de un único resultado conforme tras la sanitización.
• Repetir el mismo ciclo de sanitización después de que ya ha fallado, sin revisar sus parámetros y su cualificación.
• Planificar una repasivación como respuesta automática a cualquier coloración, sin caracterización y sin valorar los riesgos de la intervención.

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Key takeaways

• El Anexo 1 6.14 obliga a distinguir el evento aislado de la tendencia adversa: la conclusión «evento aislado» hay que demostrarla.
• Biofilm y rouging coexisten a menudo pero exigen acciones y verificaciones distintas; la investigación parte de los artefactos de toma y laboratorio, sigue con la tendencia por punto y llega a la inspección física solo con el campo ya reducido.
• Subir los límites para perseguir un sistema en deriva no es buena práctica y puede enmascarar un sistema que está fallando.
• El rouging debe caracterizarse antes de decidir: la repasivación no es automática y es en sí misma una intervención con riesgos y con necesidad de verificación.
• Una shock sanitisation no garantiza la eliminación definitiva de un biofilm maduro: penetración, distribución, eliminación y eliminación de la causa deciden el desenlace.
• La recuperación se demuestra con evidencia en el tiempo según un plan aprobado antes de la intervención, no con un único resultado conforme.

Referencias regulatorias y técnicas

• EudraLex Volumen 4, Anexo 1 (C(2022) 5938 final), en operación desde el 25 de agosto de 2023: puntos 6.7-6.15.
• Q&A de la EMA «Production of WFI by non-distillation methods - reverse osmosis, biofilms and control strategies» (EMA/INS/GMP/443117/2017), en vigor desde el 1 de agosto de 2017; EMA Guideline on the quality of water for pharmaceutical use (EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018), en vigor desde el 1 de febrero de 2021.
• USP <1231> Water for Pharmaceutical Purposes, oficial desde el 1 de diciembre de 2021: capítulo informativo, no vinculante.
• OMS TRS 1033, Anexo 3 (2021).
• ICH Q9(R1) (Paso 4, 18 de enero de 2023) e ICH Q10 (Paso 4, 4 de junio de 2008).
• PDA Technical Report No. 69 (2015), Bioburden and Biofilm Management in Pharmaceutical Manufacturing Operations.
• ASTM A967/A967M-25 (pasivación química del acero inoxidable) y ASTM A380/A380M-25 (cleaning, descaling, pickling y pasivación).
• ASME BPE, partes sobre materiales metálicos, acabados superficiales y system design (edición aplicable a fijar contractualmente); ISPE Baseline Guide Vol. 4, Water and Steam Systems, 3.ª ed., septiembre de 2019.
• FDA, Guide to Inspections of High Purity Water Systems (1993): material de referencia para los inspectores, no vinculante.