Control microbiológico y de endotoxinas en sistemas PW y WFI

Un loop de PW que lleva dieciocho meses devolviendo recuentos próximos a cero no es necesariamente un sistema limpio. Puede ser un sistema en el que el biofilm ya está maduro y estable, y en el que la muestra de rutina solo intercepta el agua que pasa. Cuando el inspector pregunta cómo se demuestra la ausencia de biofilm, la respuesta "siempre hemos tenido recuentos bajos" no es una respuesta: es exactamente el dato que produce un biofilm maduro en la mayoría de las tomas. El control microbiológico y de endotoxinas de un sistema PW o WFI no consiste en coleccionar cifras bajas, sino en construir evidencias que permitan afirmar, con justificación documentada, que el sistema está bajo control y sigue estándolo.

Por qué un recuento planctónico bajo no demuestra la ausencia de biofilm

En este punto se juega la credibilidad de toda la estrategia, y debe entenderse antes de discutir límites, medios de cultivo y frecuencias. En un sistema de agua la población microbiana existe en forma planctónica, en suspensión en el fluido, y sésil, adherida a las superficies dentro de una matriz de sustancias poliméricas extracelulares. La muestra de rutina solo mide la primera, por razones acumulativas.

• Relación superficie/volumen. La superficie interna de un anillo de distribución, del depósito, de las válvulas y de los puntos de uso es enorme frente al volumen de muestra tomado en un instante. Incluso un desprendimiento significativo de biomasa se diluye en un volumen de agua en circulación órdenes de magnitud mayor.
• El desprendimiento es discontinuo. El biofilm libera células por erosión continua a baja tasa, pero sobre todo por desprendimientos episódicos desencadenados por variaciones de caudal, transitorios de presión, arranques y paradas, choques térmicos y la apertura de puntos de uso que llevaban tiempo inactivos. Un plan de muestreo con frecuencia fija puede no captar sistemáticamente estos eventos.
• Agregación. Las células se desprenden a menudo en agregados mantenidos por la matriz. Un agregado de muchas células genera una única colonia en la placa y se cuenta como una sola unidad formadora de colonias. El recuento subestima la biomasa liberada, y lo hace de forma impredecible.
• Estado fisiológico. La flora de los sistemas de agua está adaptada a condiciones oligotróficas. Las células liberadas suelen estar estresadas, con metabolismo ralentizado o en estado viable pero no cultivable. Un método de cultivo no optimizado para esta flora las recupera mal: el resultado es una cifra baja que refleja el método, no el sistema.
• Localización. El biofilm se desarrolla donde la velocidad es baja y la superficie irregular: ramales poco usados, zonas aguas abajo de válvulas, juntas, superficies del depósito por encima del nivel de líquido. Muchos de estos puntos no son muestreables, mientras que los puntos muestreados suelen ser los mejor barridos por el flujo. El Annex 1, apartado 6.9, exige mantener el flujo turbulento precisamente para limitar la adhesión microbiana y el biofilm: es una barrera preventiva, no una prueba de ausencia.
• Efecto de la sanitización. Un ciclo de sanitización reduce la carga planctónica y las capas superficiales del biofilm, pero no elimina necesariamente la matriz adherida. En los días siguientes los recuentos vuelven a ser bajos mientras la base del biofilm sobrevive y recoloniza. Una serie de resultados bajos justo después de cada sanitización, con repunte progresivo antes de la siguiente, es un patrón que merece lectura, no archivo.

El recuento planctónico bajo es por tanto condición necesaria pero no suficiente. La demostración de control se construye combinando el recuento con su evolución temporal, el mapa punto por punto, los parámetros continuos de proceso, el historial de sanitizaciones y, cuando hace falta, evidencias directas. No es casual que el Q&A EMA/INS/GMP/443117/2017 mencione el análisis destructivo de la membrana para confirmar la ausencia de biofilm: cuando se necesita una prueba, la muestra de agua no basta.

Quién vive en un sistema de agua

El agua purificada es un entorno pobre en nutrientes y selecciona una flora específica: predominantemente bacterias Gram negativas capaces de crecer a concentraciones muy bajas de carbono orgánico, con frecuencia no fermentadoras y con fuerte tendencia a la adhesión. La literatura sobre sistemas de agua farmacéutica menciona de forma recurrente géneros como Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Sphingomonas, Methylobacterium, Stenotrophomonas. La flora real de una instalación concreta, sin embargo, no se deduce de la literatura: se determina identificando los aislados de la propia planta.

El predominio de Gram negativos tiene una consecuencia directa: su pared contiene lipopolisacárido, es decir, endotoxina. Control microbiológico y control de endotoxinas no son programas independientes, sino dos lecturas del mismo fenómeno con dinámicas distintas. La referencia técnica sectorial es el PDA Technical Report No. 69 (2015) sobre bioburden y biofilm.

Qué exige la normativa y qué no

Las monografías USP de Purified Water y Water for Injection controlan conductividad y TOC. En el plano microbiológico la USP es explícita: "Because of the various uses of these waters, microbial requirements are not included in these monographs". No existe, por tanto, un límite microbiológico compendial en monografía para PW y WFI.

El capítulo USP <1231> Water for Pharmaceutical Purposes, oficial desde el 1 de diciembre de 2021, es un capítulo general numerado por encima de 1000: es informativo y no vinculante. Indica niveles de acción de 100 ufc/mL para Purified Water y 10 ufc/100 mL para Water for Injection, descritos como niveles por encima de los cuales el agua es unfit for use y que desencadenan una investigación. En ese mismo capítulo la USP señala que corresponde a los usuarios establecer especificaciones internas o niveles microbiológicos de fitness for use. Esas dos cifras no son un requisito: son una referencia que la planta debe adoptar conscientemente, endurecer o justificar de otro modo en función del uso previsto del agua.

El Annex 1 de EudraLex Volume 4, en vigor desde el 25 de agosto de 2023, no fija cifras sino un método. El apartado 6.13 exige monitorización química y microbiológica regular y continuada, con alert levels basados en los datos de la cualificación inicial, revisados periódicamente a partir de la recualificación, la monitorización de rutina y las investigaciones. El apartado 6.14 exige que las excursiones de alert se documenten, revisen e investiguen, distinguiendo el evento aislado de la tendencia adversa o del deterioro del sistema. El apartado 6.12 prevé esterilización, desinfección o regeneración según un calendario predeterminado y como acción correctiva tras resultados fuera de límite. El apartado 6.11 exige que los filtros de venteo hidrófobos bacteriorretentivos del depósito de WFI no sean fuente de contaminación, con ensayo de integridad antes de la instalación y después del uso. El apartado 6.8 exige que la cualificación tenga en cuenta la variación estacional.

La OMS TRS 1033 Anexo 3 (2021) sigue la misma lógica: el §12.8 indica que los alert y action levels se establecen a partir de los datos históricos registrados, y el §4.3.8 que para el bulk purified water los alert y action limits derivan del conocimiento del sistema y del trending de los datos.

El Q&A EMA/INS/GMP/443117/2017 añade dos mensajes operativos: la ósmosis inversa opera típicamente a temperatura ambiente y constituye por ello un entorno ideal para la formación de biofilm; y, textualmente, "increasing of such limits is not good practice and may mask a failing system". Además pide testing ampliado en la fase inicial, incluido el testing diario de los puntos críticos, datos de aproximadamente un año para captar la variación estacional y como mínimo una evaluación anual de la eficacia de la monitorización.

En el lado FDA, 21 CFR 211.113(a) y (b) exige procedimientos escritos para prevenir microorganismos objectionable en productos no estériles y la contaminación microbiológica de productos estériles; no existe ninguna lista oficial de organismos objectionable, porque la calificación depende del producto. La Guide to Inspections of High Purity Water Systems (1993) es material de referencia para los investigadores, no vinculante.

De los niveles informativos a las especificaciones internas

La cadena lógica que aguanta una inspección es: uso previsto del agua, datos de cualificación, datos históricos, risk assessment, niveles internos. No al revés. Se distinguen tres umbrales con funciones y consecuencias distintas.

• Alert level. Umbral estadístico derivado del desempeño demostrado del sistema: según el Annex 1, apartado 6.13, a partir de los datos de la cualificación inicial y mantenido después con la monitorización de rutina. No es un criterio de calidad del agua sino una señal temprana de deriva: superarlo obliga a documentar, revisar y evaluar.
• Action level. Umbral por encima del cual se activa una acción definida, típicamente investigación e intervención sobre el sistema. Ahí se sitúa, si la planta la adopta, la referencia de USP <1231>.
• Especificación de fitness for use. El nivel ligado a la idoneidad del agua para el uso aguas abajo: forma farmacéutica, vía de administración, existencia de etapas de reducción de carga, esterilización terminal, uso como excipiente o como enjuague final. Aquí una planta estéril puede tener que ser más restrictiva que las referencias informativas.

La justificación se construye con elementos verificables: datos de cualificación por punto de uso con la variabilidad estacional observada, datos históricos y capacidad demostrada del sistema, criticidad del punto respecto al producto servido, aislados recurrentes y desempeño de recuperación del método. Un nivel no justificado es tan criticable como un nivel superado.

El método analítico: las variables que la planta debe fijar

Para el agua farmacéutica no existe un método microbiológico prescrito por monografía. Existen variables de método que cambian el resultado en órdenes de magnitud: deben elegirse, justificarse y mantenerse constantes, porque el trending solo tiene sentido con el método invariable.

Ninguno de estos valores debe copiarse de otra planta ni de un artículo: hay que establecerlos, demostrarlos y documentarlos. Los métodos microbiológicos rápidos son una opción concreta para acortar el tiempo de respuesta, que con los métodos de cultivo es la verdadera limitación operativa del control del agua; exigen, no obstante, demostración de equivalencia frente al método de referencia y gestión de la discontinuidad en la serie histórica. Para recuento y ensayo de microorganismos especificados siguen siendo aplicables los capítulos USP <61>, <62> y <1111>.

Muestreo: dos finalidades que no deben confundirse

Una muestra responde a una sola pregunta, y esa pregunta depende de cómo se tome. La muestra representativa del agua utilizada se toma en el punto de uso en las mismas condiciones en que se toma el agua para el proceso, incluidos el flexible o el racor empleados en producción: responde a la idoneidad del agua entregada. La muestra representativa del estado del sistema se toma con sanitización del punto de muestreo y purga definida, para excluir la contribución del propio punto: responde a la pregunta sobre el loop. Usar la primera para juzgar el sistema, o la segunda para liberar un lote, lleva a conclusiones equivocadas. El plan debe declarar la finalidad de cada punto, tema tratado en el artículo sobre el plan de muestreo y los puntos de muestreo.

Endotoxinas: por qué no siguen al recuento

La endotoxina es un componente estructural de la pared de las bacterias Gram negativas. Se libera durante el crecimiento y, en mayor cantidad, en la lisis celular. Esto genera dos comportamientos contraintuitivos que hay que gestionar en la estrategia.

Primero: una sanitización térmica eficaz mata las células pero no despirogena, y la lisis puede liberar endotoxina antes contenida en las células y en el biofilm. Un recuento que se desploma acompañado de una señal de endotoxinas que no baja, o que sube, es información coherente, no una anomalía analítica. Segundo: la relación entre unidades formadoras de colonias y endotoxina no es lineal ni estable, porque depende de la composición de la flora, de la fracción de biomasa no cultivable y del historial de lisis del sistema. Por eso el control de endotoxinas de la WFI es un atributo propio, con su frecuencia y sus niveles internos.

Las variables operativas del muestreo para endotoxinas difieren de las del muestreo microbiológico: recipientes y materiales libres de endotoxina, tiempos y temperaturas de conservación y adsorción en las superficies del recipiente. También aquí los valores debe fijarlos y justificarlos la planta. En cuanto a métodos, la Ph. Eur. admite el factor C recombinante (rFC) para el ensayo de endotoxinas bacterianas en las monografías del agua: decisión de la 175ª sesión (marzo de 2023), publicada en el Suplemento 11.4, con implementación desde el 1 de abril de 2024. El cambio exige igualmente validación sobre la matriz real y change control con evaluación del impacto regulatorio en los dossiers.

Los niveles internos de endotoxinas, como los microbiológicos, deben derivarse del uso previsto y de los datos del sistema, no copiarse. Las implicaciones de la elección tecnológica de generación se tratan en la comparación entre generación de WFI por membrana y destilación, donde el biofilm en sistemas a temperatura ambiente es un tema central.

Identificación y organismos objectionable

Contar no basta para investigar. La identificación sirve a tres fines: distinguir una contaminación de la muestra de una contaminación del sistema, localizar el origen comparando aislados entre puntos y en el tiempo, y valorar la relevancia del organismo para el producto.

El nivel de identificación debe graduarse según el riesgo: género para la monitorización de rutina y para construir la flora típica de la planta, especie con métodos de mayor resolución para los aislados asociados a excursiones, los recurrentes y los procedentes de puntos que sirven productos críticos. La biblioteca de aislados de la planta es lo que permite afirmar que un hallazgo es nuevo, o que se trata de la misma población que reaparece tras cada sanitización: sin biblioteca esa distinción no es demostrable.

La calificación como objectionable no es una propiedad intrínseca del organismo sino el resultado de una evaluación que considera al menos: vía de administración y población de pacientes, capacidad del organismo de sobrevivir o proliferar en la formulación, robustez de las etapas posteriores de reducción de carga, potencial patógeno y producción de endotoxina o de metabolitos que degraden el producto. El mismo género puede ser irrelevante para un producto e inaceptable para otro, y la evaluación debe estar escrita antes de la excursión.

Trending: la lectura que distingue el evento aislado del fallo del sistema

El Annex 1, apartado 6.14, pide exactamente esa distinción. Para que sea posible, el trending debe producir como mínimo: la evolución por punto de muestreo y no solo agregada, porque un problema local desaparece en la media; la identificación de shifts y drifts; la correlación con eventos del sistema, es decir sanitizaciones, mantenimientos, paradas y modificaciones; la comparación entre estaciones, coherente con el apartado 6.8 y con el horizonte de aproximadamente un año indicado por el Q&A de EMA; y la recurrencia de la misma identificación microbiana en el mismo punto.

Hay que vigilar también el fenómeno opuesto: una serie que se vuelve progresivamente más baja y más uniforme puede indicar una mejora real o una pérdida de sensibilidad del método o del muestreo. Un dato demasiado limpio merece la misma verificación que un dato fuera de límite. La monitorización continua de TOC y conductividad, exigida por el apartado 6.15 para la WFI, no sustituye al dato microbiológico pero es la única señal disponible en tiempo real entre una muestra y la siguiente: se trata en el artículo sobre monitorización de TOC y conductividad.

Gestión de la excursión

La secuencia debe estar definida en procedimiento antes de necesitarla, con responsabilidades y plazos.

1. Verificación de la integridad analítica: contaminación de la muestra, desviaciones de método, trazabilidad de la toma. No es una vía para invalidar el dato: un resultado solo se invalida con una causa analítica demostrada y documentada.
2. Evaluación del impacto en producto: qué lotes usaron agua de ese punto entre el último resultado aceptable y la excursión, con qué destino de uso y qué eventual etapa de reducción aguas abajo. Es lo primero cuando el nivel superado es de action.
3. Contención: exclusión del punto o del ramal, restricción de uso e incremento de la frecuencia de muestreo en los puntos adyacentes para delimitar la extensión.
4. Identificación del aislado y comparación con la biblioteca de la planta.
5. Investigación de la causa: intervenciones recientes, parámetros de caudal y temperatura, historial de sanitizaciones, integridad de los filtros de venteo del depósito según el apartado 6.11 y estado de los puntos de uso poco solicitados.
6. Acción correctiva, típicamente la sanitización, que el Annex 1, apartado 6.12, prevé expresamente tanto según calendario predeterminado como en respuesta a resultados fuera de límite.
7. Verificación de la eficacia con muestreo intensificado y criterios de retorno definidos por anticipado, y evaluación de si el evento constituye tendencia adversa en el sentido del apartado 6.14.

La repetición de excursiones gestionadas cada vez como eventos aislados es, en sí misma, una tendencia adversa. El camino de recuperación de un sistema colonizado se trata en el artículo sobre biofilm, rouging y recovery; la demostración de eficacia de las intervenciones se trata en la cualificación de los ciclos de sanitización.

Ejemplo aplicado: Planta Delta

Planta Delta es un ejemplo ficticio. Delta fabrica formas no estériles con un anillo de PW a temperatura ambiente alimentado por RO. Tras dos años de recuentos establemente bajos, tres puntos de uso de nueve muestran en seis semanas resultados crecientes pero siempre por debajo del action level interno: ninguna excursión formal y, por tanto, ninguna investigación automática.

La señal, sin embargo, ya está: tres puntos, el mismo periodo, una evolución monótona creciente y tres puntos que comparten el tramo terminal del anillo. El trending por punto lo hace visible; el agregado lo habría ocultado. Delta abre una evaluación antes de la excursión, identifica los aislados y encuentra la misma población en los tres puntos, verifica el caudal y comprueba que una modificación de layout ha reducido la velocidad en el tramo terminal, y lo correlaciona con el aumento estacional de la temperatura ambiente. Las acciones son de sistema, no de laboratorio: restablecimiento de las condiciones de flujo, revisión del calendario de sanitización y muestreo intensificado con criterios de retorno definidos. Lo que Delta no hace es subir el action level para devolver los datos dentro de límites.

Matriz de decisión para responder a una tendencia adversa

Los pesos los asigna el lector según su propio contexto: criticidad del producto servido, disponibilidad exigida del sistema, edad y estado de la instalación.

Errores frecuentes

• Tratar los niveles de USP <1231> como especificaciones de monografía, sin ninguna justificación interna documentada basada en el uso previsto.
• Cambiar medio, tiempo o temperatura de incubación sin change control y seguir haciendo trending como si la serie fuera homogénea.
• Muestrear siempre los mismos días de la semana y siempre después de la sanitización, obteniendo una serie histórica que describe el mejor momento del sistema.
• Considerar la monitorización en línea de TOC y conductividad un sustituto del dato microbiológico.
• No identificar nunca los aislados y, por tanto, no poder distinguir una reaparición de una contaminación nueva.
• Sanitizar con más frecuencia como respuesta estable a una tendencia creciente, sin remontarse nunca a la causa.

Red flags de inspección

• Niveles internos modificados al alza tras una serie de excursiones, justificados con el desempeño reciente del sistema.
• Alert levels no atribuibles a los datos de la cualificación inicial y nunca revisados, en contra del apartado 6.13 del Annex 1.
• Excursiones repetidas cerradas cada una como evento aislado, sin evaluación de tendencia según el apartado 6.14.
• Puntos de uso nunca muestreados por estar "poco usados", que son estadísticamente los más expuestos al estancamiento.
• Ninguna evidencia de estudios de recuperación del método con la flora real de la planta.

Si este nivel de detalle operativo te resulta útil, The Pragmatic GMP es la newsletter donde publicamos análisis técnicos y regulatorios sobre sistemas GMP. La visión completa del tema está en el hub Pharmaceutical Water & WFI Systems.

Ideas clave

• Un recuento planctónico bajo no demuestra la ausencia de biofilm: mide una fracción pequeña, liberada de forma discontinua, agregada y fisiológicamente estresada, tomada donde el flujo es mejor.
• Las monografías USP de PW y WFI no contienen requisitos microbiológicos; los niveles de USP <1231> son informativos y no vinculantes, y deben traducirse en especificaciones internas justificadas.
• El Annex 1 no impone cifras sino método: alert a partir de datos de cualificación, revisión periódica, investigación de excursiones distinguiendo evento aislado de tendencia adversa, y sanitización programada y correctiva tras resultados fuera de límite.
• Volumen, técnica, medio, temperatura, tiempo, neutralización y hold time no son requisitos compendiales: son decisiones que hay que justificar con datos de la planta y mantener estables.
• El control de endotoxinas es un atributo autónomo: no sigue linealmente al recuento y no se resuelve con la sanitización térmica. La Ph. Eur. admite rFC en las monografías del agua desde el 1 de abril de 2024.
• Subir los límites cuando el sistema los supera es la práctica que el Q&A de EMA califica de mala práctica, capaz de enmascarar un sistema que está fallando.

Referencias

• EudraLex Volume 4, Annex 1 (2022), apartados 6.8-6.15 — health.ec.europa.eu
• EMA/INS/GMP/443117/2017, Q&A sobre producción de WFI por métodos distintos de la destilación, biofilms y estrategias de control
• EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018, Guideline on the quality of water for pharmaceutical use — ema.europa.eu
• OMS TRS 1033, Anexo 3 (2021), §4.3.8 y §12.8 — who.int
• USP, monografías Purified Water y Water for Injection; capítulo general <1231>; capítulos <61>, <62>, <1111>
• Ph. Eur., monografía 0169; admisión de rFC para el ensayo de endotoxinas bacterianas en las monografías del agua, Supl. 11.4, desde el 1 de abril de 2024
• 21 CFR 211.113 — ecfr.gov
• FDA, Guide to Inspections of High Purity Water Systems (1993), no vinculante — fda.gov
• PDA Technical Report No. 69 (2015), Bioburden and Biofilm Management in Pharmaceutical Manufacturing Operations
• PIC/S PI 009-4, Aide-Memoire Inspection of Utilities — picscheme.org