USP <61> et <62> : essais des limites microbiennes

USP <61> et <62> sont les deux chapitres de la Pharmacopée américaine qui encadrent l'examen microbiologique des produits non stériles : le premier définit les essais de dénombrement (TAMC et TYMC), le second la recherche des micro-organismes spécifiés. Au laboratoire, on les cite souvent ensemble, mais ils répondent à deux questions différentes : « combien de micro-organismes y a-t-il ? » et « y a-t-il des micro-organismes inacceptables pour cette voie d'administration ? ». Les confondre — ou n'en appliquer qu'un seul quand la monographie exige les deux — est l'une des causes les plus fréquentes de spécifications incomplètes et d'écarts en audit. Dans ce guide, nous comparons les deux chapitres, avec les exigences opérationnelles de chacun et les erreurs à éviter.

USP <61> et <62> : deux chapitres, un seul système

Les deux chapitres sont conçus pour être utilisés en binôme et sont harmonisés via le Pharmacopeial Discussion Group (PDG) avec la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur. 2.6.12 et 2.6.13) et la Pharmacopée Japonaise : une méthode conforme à USP <61>/<62> est donc superposable aux chapitres européens équivalents — un avantage concret pour les sites qui libèrent sur plusieurs marchés sous BPF. Le troisième élément du système est USP <1111>, le chapitre informatif qui fixe les critères d'acceptation par forme pharmaceutique : <61> et <62> disent comment exécuter l'essai, <1111> dit quel résultat est acceptable.

USP <61> : dénombrement microbien (TAMC et TYMC)

Le chapitre <61> mesure la charge microbienne totale par deux dénombrements distincts : le Total Aerobic Microbial Count (TAMC) sur gélose caséine-soja, incubée à 30–35 °C pendant 3–5 jours, et le Total Combined Yeasts and Molds Count (TYMC) sur gélose Sabouraud dextrose, incubée à 20–25 °C pendant 5–7 jours. Le laboratoire choisit entre filtration sur membrane, ensemencement en profondeur, étalement en surface ou nombre le plus probable (NPP) selon la nature de l'échantillon et la limite à vérifier : la filtration sur membrane est préférable quand la limite est basse ou que le produit a une activité antimicrobienne éliminable par rinçages, tandis que le NPP est réservé aux cas où les autres méthodes ne sont pas applicables.

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USP <62> : la recherche des micro-organismes spécifiés

Le chapitre <62> ne compte pas : il cherche. La logique est un enrichissement en bouillon non sélectif ou sélectif, suivi d'une subculture sur milieu sélectif et d'une confirmation d'identité. Les cibles prévues par le chapitre sont :

• Bactéries Gram-négatives résistantes à la bile — enrichissement en Enterobacteria Enrichment Broth Mossel, isolement sur gélose Violet Red Bile Glucose ;
• Escherichia coli — enrichissement en bouillon MacConkey à 42–44 °C, isolement sur gélose MacConkey ;
• Salmonella — sur au moins 10 g de produit, avec bouillon d'enrichissement Rappaport Vassiliadis et gélose Xylose Lysine Désoxycholate ;
• Pseudomonas aeruginosa — isolement sur gélose à la cétrimide ;
• Staphylococcus aureus — isolement sur gélose Chapman (mannitol salé) ;
• Clostridies — Reinforced Medium for Clostridia et gélose Columbia en anaérobiose ;
• Candida albicans — bouillon Sabouraud dextrose et gélose Sabouraud dextrose.

Quelles cibles tester n'est pas au choix du laboratoire : ce sont la monographie du produit et les exigences par voie d'administration qui en décident. Un produit oral aqueux exige typiquement l'absence d'E. coli ; un topique, l'absence de S. aureus et P. aeruginosa ; une préparation rectale, en règle générale, aucun micro-organisme spécifié.

Aptitude de la méthode : là où l'on échoue

Les deux chapitres exigent la démonstration de l'aptitude de la méthode en présence du produit, et c'est là que se concentrent les écarts. Les exigences clés sont au nombre de trois. Premièrement : l'inoculum des souches de référence ne doit pas dépasser 100 UFC, avec des souches inoculées individuellement, jamais en mélange. Les souches indiquées par le chapitre harmonisé incluent S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 9027, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans ATCC 10231 et A. brasiliensis ATCC 16404 (ou des équivalents d'autres collections reconnues comme NCIMB, CIP, NBRC). Deuxièmement : pour <61>, la récupération en présence du produit ne doit pas différer d'un facteur supérieur à 2 par rapport au témoin sans produit ; si le produit est inhibiteur, il faut appliquer des neutralisants, des dilutions ou une filtration avec rinçages, et documenter ce choix dans la procédure. Troisièmement : un témoin négatif doit accompagner chaque exécution de l'essai pour démontrer l'absence de contamination liée à la procédure. Une aptitude réalisée une seule fois et jamais réévaluée après des changements de formulation est un écart classique : le rationnel de sa validité dans le temps doit être écrit, pas présumé.

Critères d'acceptation : le rôle d'USP <1111>

Les résultats de <61> et <62> s'interprètent avec les critères d'USP <1111>, harmonisé avec la Ph. Eur. 5.1.4. Pour les formes orales aqueuses, la référence type est TAMC 10² UFC/g ou mL et TYMC 10¹, avec absence d'E. coli dans 1 g ou mL ; pour les orales non aqueuses, TAMC 10³ et TYMC 10² ; pour les voies cutanée, nasale et auriculaire, TAMC 10² et TYMC 10¹ avec absence de S. aureus et P. aeruginosa ; pour la voie inhalée s'ajoute l'absence de Gram-négatifs résistants à la bile. Attention à l'interprétation des limites, souvent erronée dans les procédures : un critère de 10² UFC correspond à un maximum acceptable de 200 UFC, et non de 100, car le chapitre tient compte de la variabilité intrinsèque de la méthode de dénombrement. Et respecter les limites de <1111> ne clôt pas le sujet : l'évaluation des micro-organismes « objectionable » pour le produit, le procédé et le patient reste de la responsabilité du fabricant, comme la FDA le rappelle systématiquement lors des inspections des non stériles.

Recommandation GuideGxP

Dans les spécifications et les procédures, traitez <61> et <62> comme un système unique : une spécification produit citant TAMC, TYMC et les micro-organismes spécifiés avec la quantité d'échantillon ; une aptitude documentée pour chaque matrice, avec un rationnel de réévaluation à chaque changement de formulation ou de fournisseur ; l'interprétation des limites écrite noir sur blanc (10² = maximum 200 UFC) pour éviter des OOS déclarés par excès de zèle ; et un rationnel documenté sur les micro-organismes « objectionable » au-delà des cibles de <62>. En audit, la question ne sera pas « réalisez-vous l'essai ? » mais « pourquoi votre méthode est-elle apte pour ce produit ? ».

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Sources officielles

• USP <62> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms (USP–NF)
• USP – FAQ: Microbial Examination of Nonsterile Products (<61>/<62>)
• FDA – Microbiological Quality Considerations in Non-Sterile Drug Manufacturing (Guidance)